Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
120
Глава 4
личество МЭС в кислой форме для доведения pH до 6,5 [49]. МЭС становится теперь главным компонентом буфера, содержащего Н-трис+ просто в качестве противоиона, и образец фермента сразу же наносится на КМ-целлюлозу, на которой он в? большинстве случаев адсорбируется.
Если фермент адсорбировался на одной из колонок и был успешно элюирован солевым раствором, имеет смысл уточнить pH, при котором он адсорбируется. Для этого следует проверить, будет ли он адсорбироваться, например на КМ-целлюлозе при более высоком значении pH и на ДЭАЭ-целлюлозе при более низком. В этих условиях может снизиться сорбция других белков. Необходимые для этого буферные растворы описаны ниже. Повышение ионной силы, например добавлением 50 мМ или 0,1 М КС1 к буферу при том же значении pH, дает тот же эффект. На рис. 4Л6 приведена схема таких пробных опытов.
Буферы, используемые в ионообменной хроматографии
Для успешной работы с белком решающее значение имеет правильный выбор буфера. Поддержание pH в ходе ионообменной хроматографии имеет первостепенную важность, так как ионные взаимодействия сильно зависят от pH, а буферные растворы содержат ионы, которые могут принимать участие в процессе ионного обмена. В большинстве случаев лучше, если буферные ионы не взаимодействуют с адсорбентом, т. е. заряженные формы буфера должны иметь заряд того же знака, что к заместители адсорбента. Если это не так, то могут произойти нежелательные и непредвиденные изменения pH в микросреде, окружающей адсорбированные белки, что повлечет за собой в лучшем случае изменение сил взаимодействия, а в худшем — денатурацию белка. Однако в литературе есть много примеров, когда нарушение этого правила не мешает достижению желаемых результатов; его соблюдение менее важно, если можно использовать высококонцентрированные буферы. Наиболее обычным отступлением от этого правила является использование фосфатных буферов в анионообменной хроматографии; иногда фосфат необходим для поддержания стабильности фермента. Насколько возможно, рекомендуется соблюдать это правило и работать только с простыми анионами (например, С1_, ацетат) в экспериментах с ДЭАЭ-адсорбентами и с простыми катионами (например, К+, Na4", Mg2+ Н-трис+ при рН<7) при использовании КМ-адсорбентов и других катионообменников. Следует помнить, что полианионные комплексообразующие агенты, такие, как ЭДТА, связываются с ДЭАЭ-целлюлозой, накаплива-
Разделение белков путем адсорбции
121
ются на адсорбенте и могут конкурировать с белками за центры «связывания.
Часто необходимо иметь максимальную буферную емкость при минимальной ионной силе, чтобы обеспечить адсорбцию слабо связывающегося белка. Для того чтобы достичь этого, нужно соблюдать два других правила. Во-первых, величина рКа буфера не должна отличаться больше чем на 0,5 единицы, л лучше — не больше чем на 0,3 единицы от значения pH используемого буфера. Во-вторых, одан из компонентов не должен быть заряжен, чтобы не повышать ионную силу. При работе с ДЭАЭ-целлюлозой (pH 8,0) буфер трис-С1 удовлетворяет всем трем требованиям: противоионом служит С1_, рКа триса равно 8,1 (при 25 °С; см. разд. 6.1) и буфер состоит из Н-трис+ (не взаимодействует с адсорбентом) и триса (нейтральный). Для КМ-целлюлозы при pH 6,5 подходит буфер -К-МЭС: противоионом служит К+, величина рКа МЭС составляет 6,2 и буфер состоит из Н-МЭС (нейтральный) и МЭС~ (не взаимодействует с адсорбентом). С другой стороны, при использовании фосфата на ДЭАЭ-целлюлозе нарушаются два (по крайней мере) из этих правил, так как здесь имеются противоположно заряженные ионы и ни один из буферных компонентов не нейтрален (НР04”2 и Н2Р04“). При использовании фосфата на КМ-целлюлозе нарушается только последнее правило.
Список других возможных буферов приведен в гл. 6 (см. табл. 6.3), другие списки можно найти в литературе (например, [50—52]).
Различные буферы, используемые для ионного обмена, приведены в табл. 4.6. Концентрация ионной и нейтральной форм буфера должна составлять по меньшей мере 5 мМ. Таким образом, при использовании трис-CI на ДЭАЭ-целлюлозе буфер должен содержать не менее 10 мМ триса, pH которого доведен до значения его рКа с помощью НС1. Удобнее всего готовить буфер из 10 мМ НС1, доводя его pH до нужного значения незаряженным основанием (в данном случае трисом); преимущество этого способа состоит в том, что ионная сила точно известна (0,01 Н-трис+-С1_). При работе с катионообменниками делают наобарот, а именно 10 мМ КОН титруют до нужного значения pH с помощью МЭС. Следует помнить о влиянии температуры на величины рКа (разд. 6.1), особенно если буфер готовят при комнатной температуре, а используют на холоде. К сожалению, при воспроизведении опубликованных методик редко бывает ясно, в каких условиях доводили pH до нужной величины— на холоде или при комнатной температуре.
Если интересующий нас фермент сильно адсорбируется при низкой ионной силе, можно ее повысить, или добавляя к раствору нейтральную соль (КС1, NaCl), или повышая концентра-
