Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 46

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 145 >> Следующая

Таблица 4.5. Выбор ионообменника для очистки белка с известной изоэлектрической точкой (предполагается, что белок стабилен только при pH 5,5—8,5)
I Ноэлектриче- Ионный обмен pH буфера
ская точка
8,5 Катион <7,0
7,0 Катион <6,0
Анион >8,0
5,5 Анион >6,5
118
Глава 4
Однако все это относится к белкам, которые ведут себя идеально и не адсорбируются при значениях pH, не соответствующих их изоэлектрической точке, а их величины а не достигают приемлемого значения (>0,9) до тех пор, пока pH не будет на 1 или 1,5 единицы отличаться от изоэлектрической точки с «правильной» стороны. Существует несколько проверенных случаев, когда эта простая концепция оказывается неверной: белок адсорбируется на катаонообменнике даже при pH, значение которого лежит на 1 единицу выше его изоэлектрической точки [48], или, ^наоборот, на анионообменнике при значении pH на
1 единицу ниже этой точки. Существуют «лмпкие» белки, которые связываются с ионообменниками обоих типов в одном и том же буфере, и «скользкие» белки, с трудом связывающиеся с адсорбентом в области pH, где фермент сохраняет стабильность. Эти эффекты обусловлены частично неэлектростатаческими взаимодействиями, такими, как гидрофобные и вандерваальсо-вы силы, и частично неравномерным распределением зарядов на поверхности белка. Скопление одинаково заряженных групп, особенно в активном центре, который связывает высокозаряженный субстрат, может привести к адсорбции белка, несмотря на то что суммарный средний заряд последнего имеет другой знак [29]. Этот эффект описан далее более детально в разд. 4.4.
Предварительная проверка поведения белков при ионном обмене
На практике условия адсорбции выбирают эмпирически. Хотя изоэлектрическую точку фермента можно определить, проведя предварительный эксперимент по аналитическому изоэлек-трическому фокусированию исследуемого фермента в сочетании со специфическим окрашиванием на ферментативную активность, для этого может быть достаточно и простого эксперимента с применением ионообменников. Чтобы заменить буфер в содержащем фермент препарате, небольшой его образец можно пропустить через гель-фильтрующую колонку. 1 мл препарата пропускают через колонку объемом 10 мл примерно за 10 мин (см. табл. 1.2). Для испытания адсорбционной способности ДЭАЭ-целлюлозы используют 20 мМ трис-буфер, pH 8,0 (о буферах см. ниже). Для этого достаточно небольшой колонки объемом около 2 см3, предварительно уравновешенной трис-бу-фером. Если фермент не адсорбировался на ДЭАЭ-целлюлозе, то а) в результате, возможно, произошла значительная его очистка, так как много других белков могли адсорбироваться на ионообменнике, и б) фермент, вероятно, будет адсорбироваться на КМ-целлюлозе. Чтобы проверить последний вывод, во втором эксперименте в качестве буфера используют 20 мМ
Разделение белков путем адсорбции
119
N-морфолиноэтансульфонат (МЭС), pH 6,5, и КМ-целлюлозу. Если фермент адсорбируется на обоих ионообменниках (или по крайней мере исчезает из неадсорбированной фракции), следует сразу же обработать колонку 10 М КС1. Такая ионная сила обычно вполне достаточна, чтобы элюировать все белки. Затем проводят проверку, чтобы убедиться, что фермент сошел с колонки. Иногда «адсорбция» фермента на самом деле представляет собой его «инактивацию», поэтому, перед тем как переходить к работе с большими объемами, необходимо определить процент выхода активности.
Следующий этап зависит от результатов предыдущего опыта. Если фермент не адсорбируется ни на одном из использованных ионообменников, это указывает на то, что достигнута высокая степень очистки. Образец можно пропустить через колонки с двумя этими адсйрбентами в буфере с промежуточным значением pH, например 7,0. Обе колонки можно соединить вместе или же собрать элюат из первой колонки и довести его pH до нужного значения; последний вариант предпочтителен, так как позволяет не менять самого буфера.
Особенно удобно использовать трис-буфер, с pH доведенным до 8,0 с помощью МЭС, для пропускания образца через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. При этом происходит удаление значительного количества ненужных белков; затем к неадсорбированной фракции, содержащей фермент, добавляют еще некоторое ко-
Результаты, полученные на : ДЭАЭ КМ
pH 8 pH 6,5
I___^Используйте буфер с pH 7,0 в двух
| соединенных между собой колонках
Используйте ДЭАЭ при pH 6,0 или при pH 8,0 0,1 М соль
N
Проведите элюцию с одной колонки,
смените буфер и адсорбируйте ^_____
фермент на другой колонке
и—и
Попробуйте затем КМ при pH 6,0 или ниже, ДЭАЭ при pH 8,5, ЧАЭ при pH 9,0 или выше
' Попробуйте КМ при pH 7,0 или при pH 6,5 + 50 мМ соль
Рис. 4.16. Схема проведения предварительных опытов по адсорбции белков на ионообменниках и последующей их элюции. N —белок не адсорбируется, А — белок адсорбировался.
Предыдущая << 1 .. 40 41 42 43 44 45 < 46 > 47 48 49 50 51 52 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed