Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Солевые градиенты — это самые обычные способы элюции белков с ионообменников. Поскольку изменения pH в колонке можно «поддерживать» за счет буферного действия белков и группировок носителя, соли свободно проходят через колонку, если не обмениваются на противоионы. Но даже в этом случае концентрация соли сохраняется на прежнем уровне, хотя состав ее изменяется. Обычно для получения градиента используют хлориды калия или натрия; линейный градиент создают с помощью простого смесителя (см. рис. 4.19). Можно представить себе два способа действия солей. Соль может непосредственно вытеснять белок; ионы (например, хлорид-ионы в ДЭАЭ-адсорбентах) занимают положительно заряженные центры связывания и блокируют присоединение к ним белков. Можно также предположить, что вся система находится в состоянии равновесия, при котором даже прочно связывающиеся белки какое-то время остаются неадсорбированными; в присутствии ионов соли значительно ослабляется притяжение между свободным белком и адсорбентом. В любом случае десорбированный белок замещается противоположно заряженными ионами,
и, следовательно, «ионный обмен» — это точное описание данного процесса.
По мере повышения концентрации соли снижается величина а. При использовании колоночной хроматографии это означает, что белки начинают двигаться вниз, а так как они перемещаются с меньшей скоростью, чем соль, то каждая часть белковой зоны постоянно испытывает действие повышенной концентрации соли. Это приводит к тому, что зоны сужаются. Передняя граница становится резкой под влиянием эффектов, описанных ранее, а также вследствие градации условий по длине колонки, в результате чего потенциальная величина а впереди зоны еще более повышается (рис. 4.14). Задняя граница белковой зоны, находящаяся в условиях отсутствия градиента, должна была бы запаздывать из-за повышения а, но благода-
8*
&6Л0К
116
Глава 4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
30
25
20
15
10
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
35
30
25
20
15
0,2 0,3 0,4
0,5 ¦^0,6
40
35
30
25
20
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Рис. 4.14. ЭЛюция белков в градиенте соли. Слева от каждой диаграммы даны значения концентрации соли в колонке (мМ); справа—соответствующие величины а (для простоты изменения а в зависимости от концентрации белка не учитывались). Полоса белка движется быстрее с повышением концентрации соли и выходит из колонки при а=0,5.
ря более высокой концентрации соли ее перемещение ускоряется. Истинная величина а может не повышаться или даже понижаться непосредственно за основной частью зоны. Эффект сужения зоны под влиянием градиента представлен на рисунках 4.14 и 4.15. Использование ступенчатого повышения концентрации соли для элюции белков описывается в следующем разделе.
4.3. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРАКТИЧЕСКИЕ
АСПЕКТЫ
Изоэлектрическая точка белков зависит от наличия в их структуре различных ионизируемых остатков аминокислот, no-
1,о
0,5
1,0
0,5
Рис. 4.15. Элюция белка (сплошная линия) в градиенте концентрации соли. Изменение а с концентрацией белка приводит к тому, что без градиента (Л) наблюдается существенное размывание пика (образование «хвоста»), С градиентом (5) размывания не происходит и элюция осуществляется быстрее.
Разделение белков путем адсорбции
117
ложительные заряды несут остатки арлинина, лизина (в основном при pH ниже 9,5) и гистидина (при pH ниже 7,0). Все N-концевые аминогруппы при pH ниже 8 также несут положительный заряд. Если не работать при слишком высоких значениях pH, например при pH выше 8,5, то все остатки аргинина и лизина можно считать положительно заряженными. Отрицательные заряды несут главным образом остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот, и при pH выше 6 практически все эти остатки, а также С-концевые карбоксильные группы ионизированы. При высоких значениях pH (>8) остатки цистеина также ионизируются. Небольшое число остатков, обычно входящих в активный центр фермента, могут быть исключением из общего правила и иметь величины рКа, отличающиеся от нормы на несколько единиц. Например, в активном центре фермента креатинкиназы расположен ионизированный остаток цистеина с рКа меньше 7 [47]. В пределах нормальных значений pH, при которых сохраняется стабильность фермента на ионообменной колонке, а именно при pH 5,5—9, различия в величине суммарного заряда в основном создаются за счет остатков гистидина, так как значения его рКа лежат в пределах б—7. Следовательно, белок, содержащий мало гистидина, будет вести себя практически одинаково в довольно широкой области pH. В этом случае значение pH не будет иметь решающего значения. Наоборот, суммарный заряд белков с большим содержанием гистидина будет существенно меняться с изменением pH, и значения pH, использованные при адсорбции или элюции белков, будут весьма важны. При значениях pH выше 9 и ниже 5,5 процесс титрования групп белка усиливается, и небольшие изменения величины pH могут значительно повлиять на адсорбцию (на Кр и величину а). Узкая область стабильности ферментов часто ограничивает пределы используемых значений pH, и если изоэлектрическая точка находится вне области стабильности, то, как показано в табл. 4,5, можно использовать ионообменники только одного типа.
