Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
О других модификациях носителей до сих пор не упоминалось в основном потому, что в большинстве случаев все необходимые процедуры могут быть проведены с помощью одного ка-тионообменника и одного анионообменника. При слишком большом выборе материалов много времени затрачивается на то, чтобы опробовать каждый из них. Теперь мы все же дадим описание некоторых других материалов и их свойств. При крайних значениях pH как КМ-, так и ДЭАЭ-заместители становятся незаряженными. Если необходимо использовать анионообменник при pH выше 9 или катионообменник при pH ниже 4 (лишь немногие ферменты стабильны в этих условиях), нужны другие модификации. К гранулам целлюлозы или декстрана были при-
Разделение белков путем адсорбции
1Ш
Таблица 4.4. Некоторые имеющиеся в продаже ионообменники
Анионообменники Катионообменники
На основе целлюлозы
Сефацелы (сферические целлюлозы)
Сефадексы (сферические декстрана)
На основе агарозы
ДЭАЭ2- 3> ТЭА32>
ЧАЭ (QAE)2) гранулы ДЭАЭ3)
гранулы ДЭАЭ1*
ЧАЭ (QAE)1*
ДЭАЭ1’ 2>
ПЭИ (полибуфер-ные ионообменники)
На основе синтетического полимера ДЭАЭ4)
(трисакрил)
КМ2- 3> Фосфо2' 3J
KiM1*
Сульфопропил
(СП)1»
КМ1* й>
КМ4
*) Pharmacia.
2) Bio-Rad. s) Whatman.
*) LKB.
Сокращения: ДЭАЭ — диэтил аминоэтил; ТЭАЭ — триэтиламиноэтил; ЧАЭ (QAE) —
ди-*тил- (J- гид роке it пропил) -а ми псы ил (четвертичный аминоэтнл); ПЭИ — полиэтиленими-но; КМ — карбоксиметил.
соединены сульфоэтиловые или сульфопропиловые группы, остающиеся ионизированными при pH ниже 2. В анионообменни-ках четвертичные аммониевые группы ионизированы даже при pH 12. На рис. 4.9 приведены кривые титрования замещенных сефадексов в 1 М КС1. Хотя ЧАЭ((ЗАЕ)-сефадекс имеет на кривой титрования небольшой изгиб при pH 7, он полностью положительно заряжен при всех значениях pH ниже 12. Аналогично СП-сефадекс полностью отрицательно заряжен при значениях pH выше 2. КМ-сефадекс (и другие карбоксиметилсо-держащие материалы) нитруются при pH около 4,5, и их можно считать полностью отрицательно заряженными при pH выше
5,5. ДЭАЭ-замещенные материалы (это относится как к целлюлозам и агарозе, так и к декстранам) обладают более сложными свойствами, и их можно считать полностью положительно заряженными только при pH ниже 5. Хотя диэталаминоэтиль-ная группа имеет рКа в области 9—9,5, отмечено, что ДЭАЭ-замещенные материалы титруются при pH 6—8 (рис, 4.10). Это происходит из-за того, что в результате электростатического отталкивания протонов близко расположенные заместители влияют на величины рКа друг друга. Таким образом, ДЭАЭ-целлю-лоза, наиболее часто используемый ионообменник, имеет сложную структуру и сложную кривую титрования, причем в обычно используемых буферных растворах при pH 6—9 некоторые груп-
110
Глава 4
Миллиэквиваленты NaOH Миллиэквиваленты НСI
Миллиэквиваленты NaOH Миллиэквиваленты NaOH
Рис. 4.9. Кривые титрования ионообменных сефадексов в 1 М KCI. (С любезного разрешения фирмы Pharmacia Fine Chemicals [41].)
пы адсорбента ионизированы только частично. Это, однако, не умаляет ее достоинств. Большая часть схем элюции была разработана эмпирически, и поэтому указанные свойства адсорбента не имеют большого значения. Однако стоит отметить, что при более низких значениях pH, при которых лишь немногие белки несут отрицательный заряд, достаточный для адсорбции на различных ДЭАЭ-производных, емкость адсорбента для белков, все же способных связываться с ним, возрастает. Следовательно, вероятность того, что адсорбент будет перегружен, уменьшается при использовании буфера с более низким значением pH.
Разделение белков путем адсорбции
111
Миллиэквиваленты HCI Миллиэквиваленты NaOH
Рис. 4.10. Кривые титрования ДЭАЭ-сефарозы и КМ-сефарозы в 1 М КС1. (С любезного разрешения фирмы Pharmacia Fine Chemicals [41].)
При работе с ЧАЭ- и СП-сефадексами возникают проблемы набухания и усадки, о которых мы уже говорили выше. Целлюлоза, замещенная триэтиламиноэтильной, т. е. четвертичной, аммониевой группой (ТЭАЭ-целлюлоза), в течение некоторого времени была довольно распространенным ионообменником. Кривая ее титрования, однако, не сильно отличается от соответствующей кривой для ДЭАЭ-целлюлозы. Из этого следует, что на самом деле лишь незначительное число групп в ней представляет собой четвертичные аммониевые группы. Другие заместители, такие, как ЭКТЭОЛА и аминоэтильная группа, сейчас почти не используются. В идеале было бы вполне достаточно иметь два ионообменника (ни один из которых не выпускается промышленностью): модифицированную четвертичными аммониевыми группами агарозу с поперечными сшивками (или сферические гранулы целлюлозы, либо материал на основе органических полшмфов) в качестве анионообменника и агарозу, модифицированную сульфопропильными группами в качестве ка-тионообменника. Но бывают случаи, когда специально выбирают адсорбент с низкой емкостью для белков — необходимый белок связывается очень прочно, остальные же совсем не связываются. При высокой степени модификации ионообменника прочность связывания может быть настолько велика, что белок совсем не выходит из колонки. В этих случаях можно использовать стандартные материалы с определенной, более низкой степенью модификации. Причиной того, что более низкая степень
