Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Пируваткиназа 228 000 12,5 0,055
!) См. рис. 4.8, где эти данные представлены в виде графика.
Примечание: если источник не указан, то это значит, что фермент выделен из мышц
кролика.
Данные взяты из работы Скоупса [38].
чиной внутреннего объема частицы, доступного для белков, и так же, как и при гель-фильтрации, зависит лишь от размера пор. Как показано на рис. 4.8, емкость, выраженная в мг-см-3, повышается по мере снижения молекулярной массы белков так, что зависимость емкости от log мол. массы представляет собой почти прямую линию. Интересно отметить, что адсорбент, уже «насыщенный» крупными молекулами белка, все еще способен связывать молекулы небольшого размера при условии, что поры стерически не блокированы крупными молекулами. Для подтверждения этого был проведен эксперимент на КМ-целлюлозе при pH 6,0 в условиях, описанных на рис. 4.8. Было показано, что при обработке 1 см-3 КМ-целлюлозы избытком пируватки-назы мышц кролика (мол. масса 228 000) адсорбировалось 13 мг фермента. КМ-целлюлозу промывали буфером, а затем добавляли 50 мг лизоцима (мол. масса 14 500). Весь лизоцим полностью адсорбировался на КМ-целлюлозе; при этом вытеснения пируваткиназы не наблюдалось. Отсюда следует, что перегрузка колонки может привести к тому, что сначала из колонки будут выходить более крупные молекулы, так как емкость адсорбента может быть достаточной для адсорбции всех более мелких молекул — это будет зависеть от соотношения больших и малых молекул в наносимом образце. Новейшие ионообменники имеют более высокий верхний предел исключения. Так, трис-акрил фирмы LKB способен адсорбировать вещества с мол. массой до 107 [40].
Разделение белков путем адсорбции
107
Рис. 4.8, Емкость КМ-целлюлозы для различных белков (в условиях, когда а=1,0). Использованы следующие белки: 1 — лизоцим из
белка куриных яиц; 2—
АМР-киназа; 3 — фос-фоглицераткиназа (емкость одинакова как для препарата из дрожжей, так и для препарата из мышц кролика); 4 — фосфоглицератмутаза;
5 — креатинкиназа (при 0 °С); 6 — енолаза; 7 — лактатдегидрогеназа;
8 — глицеральдегидфос-фатдегидрогеназа; 9 — альдолаза; 10 — пиру-ваткиназа [38].
Типы ионообменников
За долгие годы разработано множество различных типов ионообменников, но значительная их часть не нашла широкого применения или была вытеснена более совершенными материалами. Начинающий исследователь может ограничиться в своей работе только двумя типами смол — катионообменником (кар-боксиметилпроизводным) и анионообменником (диэтиламино-этилпроизводным). Хотя фосфоцеллюлоза применяется для многих целей, есть много данных, свидетельствующих, что она сочетает свойства и ионообменника, и аффинного адсорбента, обладающего специфическим сродством к ферментам, субстратами которых служат фосфорные эфиры; поэтому фосфоцеллюлоза относится к особой категории адсорбентов. Чтобы получить подходящие материалы для ионообменной хроматографии белков, к целлюлозе, агарозе и декстрану были присоединены карбоксильные и диэтиламиноэтильные группы. Ранее в качестве адсорбентов использовали крупные частицы целлюлозы, обладающие рядом полезных свойств, таких, как быстрая флоккуляция и хорошая скорость потока в колонке. Однако эти адсорбенты имели относительно небольшое число центров связывания для белков, особенно для крупных белковых молекул, что обусловлено микроструктурой их частиц, так что емкость этого материала была ограниченной. Усовершенствованная, микрокристаллическая, целлюлоза была разработана фирмой Whatman, и два ионообменника на ее основе, КМ-32 и ДЭ-32 (в виде сухих порошков), а также КМ-52 и ДЭ-52 (влажные, спрессованные волокна) нашли широкое применение. Эти материалы и до
Логарифм молекулярной массы
103
Глава 4
сих noip могут конкурировать, по крайней мере в цене, с более новыми и более сложными материалами.
При присоединении этих заместителей к сферическим частицам декстрана (сефадекс фирмы Pharmacia) были получены адсорбенты с высокой емкостью и надежно воспроизводимыми свойствами. Однако они оказались не очень удачными из-за их усадки при замене буфера. В воде мягкие гранулы декстрана сильно разбухают вследствие того, что между одноименными зарядами внутри модифицированных гранул возникают силы отталкивания;'при этом получается почти прозрачная суспензия. Силы отталкивания ослабевают по мере повышения концентрации соли, и гранулы сжимаются. Это явление нежелательно, если оно происходит в колонке. Усадка материала в колонке, обусловленная сжатием гранул, не только порождает технические затруднения, связанные с увеличением мертвого пространства и нестабильным градиентом, но и может привести к тому, что белки, особенно крупные, захватываются гранулами и не элюируются с колонки. Таким образом, декстрановые ионооб-менники следует использовать лишь в тех случаях, когда образец можно нанести на колонку при относительно высокой ионной силе (>0,1) или же когда ионная сила остается постоянной, а белки вымываются из колонки путем изменения pH и (или) с помощью аффинной элюции (разд. 4.4). Более удачными материалами, выпускаемыми фирмой Pharmacia (и другими поставщиками), являются модифицированные поперечно-сшитые гели агарозы такие, как ДЭАЭ-сефароза. Гранулы геля агарозы имеют высокий предел исключения, поэтому их можно использовать при работе с белками, размер молекул которых достигает 106 дальтон. Из-за наличия поперечных сшивок гель агарозы обладает значительной жесткостью и объем его мало меняется при изменении условий. Фирма Pharmacia производит также сферические гранулы целлюлозы: в настоящее время используется только ДЭАЭ-сефацел. Некоторые, наиболее известные ионообменниш приведены в табл. 4.4.
