Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
1 моль при заряде z равна
dG° d\0QKP
= -2’3RT —Цг^=-2’3*Т5-
dG°
Величины - для различных белков даны в табл. 4.2. Видно, что эти
величины различаются лишь незначительно, в основном они лежат в пределах 1—2 кДж-моль~1. Однако наименьший из исследованных белков, миокиназа (мол. масса 21 500), имеет наибольшую величину; это указывает на то, что дополнительные положительные заряды, приобретаемые данным белком в процессе титрования в пределах pH 7,5—6,0, сильнее взаимодействуют с ионообменником, чем положительные заряды на более крупных молекулах. Это происходит либо вследствие того, что молекулы меньшего размера способны более плотно упаковываться на ионообменнике (подтверждено экспериментами по определению емкости, см. ниже), либо потому, что в более мелких молекулах каждый заряд расположен в среднем значительно ближе к поверхности белковой молекулы, и поэтому электростатическое притяжение ионизированными карбоксиметильными группами адсорбента оказывается намного сильнее. Для того чтобы оценить число ионизированных групп, взаимодействующих с каждым зарядом белка, можно использовать соответствующие расстояния между усредненным аминокислотным остатком белковой молекулы и ионизированными карбоксиметильными группами, а также ди-
Разделение белков путем адсорбции
105
Таблица 4.2. Изменение энергии взаимодействия ферментов с КМ-целлюлозой в расчете на один положительный заряд фермента
Фермент dGbjdz, кДж- моль-1
Фосфоглицераткиназа из дрожжей 2,0
AMP-киназа из мышц кролика 4,2
Креатинкиназа из мышц кролика 1,5
Альдолаза из мышц кролика 0,9
Ппруваткиназа из мышц кролика 1,0
Пируваткиназа из дрожжей 1,7
Лактатдегидрогеназа из мышц кролика 0,7
Митохондриальная аспартатаминотрансфераза из серд 0,9
ца быка
электрическую постоянную D для воды и величину, равную
2 кДж-моль-1 в расчете на каждый заряд, в уравнении (4.8):
E = -=WT-' (4-8)
где 2^2 —заряды на притягивающихся компонентах (—гх для белка и z2 для адсорбента), г — расстояние между ними; если принять, что оно равно 5 нм, то
Е (в расчете на заряд zx) — — za/D*r = 2 кДж-моль-1.
Отсюда z2 равно приблизительно —5, т. е. в среднем 5 карбоксиметиль-ных групп оказывают влияние на каждый положительный заряд белка. В основе этих вычислений лежат весьма широкие допущения, но по крайней мере величина, полученная для z2, вполне приемлема, если принять во внимание вероятную пространственную плотность заряженных кластеров карбоксиметильных групп по отношению к размерам белковых молекул.
Адсорбционная емкость ионообменников
Количество белка, которое может связать ионообменник в расчете на единицу объема, может быть очень большим. Однако у обменников классического типа, таких, как материалы на основе целлюлозы, это количество зависит в основном от размеров белковых молекул — чем мельче молекулы белка, тем в большей степени он адсорбируется. При выражении количества белка в молях это различие еще увеличивается. Некоторые типичные величины даны в табл. 4.3. Молекулы белков с мол. массой более 10б не задерживаются (исключаются) большинством целлюлозных ионообменников. Здесь проявляется практически тот же ситовой эффект, что и при гель-фильтрации (разд. 5.1). Крупные молекулы могут присоединяться только к поверхности частиц ионообменника, и поэтому емкость ионооб-менника для них очень низка. Общая емкость связана с вели-
106
Глава 4
Таблица 4.3. Емкость КМ-целлюлозы (Whatman СМ 52) для различных белков при а=1,0 (pH 6,0, I—0,01)1)
Белок Мол. масса Емкость, Емкость m^t
мг-см---* мМ
Лизоцим из белка куриного яйца 14 300 130 9,0
АМР-киназа 21 400 100 4,6
Фосфоглицераткиназа из дрожжей 45 000 70 1,55
и мышц кролика
Фосфоглицератмутаза 60 000 40 0,67
КреатинкинаЗа 82 000 35 0,43
Енолаза 88 000 48 0,55
Лактатдегидрогеназа 140 000 21 0,15
Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа 145 000 26 0,18
Альдолаза 160 СОО 22 0,14
