Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 40

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 34 35 36 37 38 39 < 40 > 41 42 43 44 45 46 .. 145 >> Следующая

Белок затем замещает хлорид-ионы и занимает центры связывания на адсорбенте, при этом образуется трис-С1. Следует отметить, что трис-С1 представляет собой кислую соль триса, и, если замещение идет быстро, в колонке может произойти сни-
102
Глава 4
Рис. 4.6. Схема «ионного обмена», происходящего при адсорбции отрицательно заряженного белка на ионообменнике. Семь положительно заряженных ионов (например, Н-трис+), ассоциированных с молекулой белка, вытесняются из ионообменника вместе с семью отрицательными ионами (С1~).
жение эффективного значения pH впереди зоны адсорбированного белка.
К тому же образование трис-С1 приводит к повышению ионной силы буфера, проходящего через колонку. Обычно на каждый 1 мг-мл-1 адсорбированного белка дополнительно образуются соли буфера в концентрации 1 мМ. При высокой концентрации нанесенного образца pH неадсорбированных фракций будет ниже, чем pH предшествовавшего промывочного буфера (или выше, если речь идет о катионообменнике). Для того чтобы избежать этих изменений величины pH и ионной силы, в результате которых адсорбция может быть ниже ожидаемой величины, концентрация наносимого на колонку белка не должна быть слишком высокой — особенно если предполагается, что значительная его часть адсорбируется на колонке. Это означает также, что необходимо использовать растворы, обладающие достаточной буферной емкостью, — в отсутствие буфера могут произойти значительные изменения pH, приводящие к денатурации белка. Обычно используют буфер, минимальная концентрация которого составляет 10 мМ при значении pH, отличающемся не более чем на 0,3 единицы от величины его рКа (см.
Разделение белков путем адсорбции
103
табл. 4.6 и разд. 6.1). Концентрация адсорбируемого белка не должна превышать 5 мг-мл"1 (неадсорбируемые белки оказывают меньшее влияние; ср. разд. 4.3).
Предполагается, что существуют две формы взаимодействия белков с ионообменниками в процессе адсорбции. Одна из них называется «необратимым», а другая «обратимиым» связыванием. Как отметил Петерсон [39], термин необратимое связывание неудачен, так как он подразумевает, что адсорбированный белок уже не выходит из колонки: связывание такого типа нельзя было бы использовать. Переходы от так называемой необратимой адсорбции к обратимой вследствие непрерывного изменения состава буфера должен быть постепенным. Вероятность того, что диссоциация молекулы белка происходит за 1 с при «обратимой» адсорбции, может составлять 99%, а при «необратимой» — 0,001 % (эта величина никогда не бывает равной нулю); однако положение границы между этими двумя типами адсорбции — поистине весьма спорный вопрос. Указанную вероятность можно рассчитать из кривых зависимости адсорбции от pH, показанных на рис. 4.4, но часто используют другой способ выражения распределения адсорбированного на ионообменнике и неадсорбированного белка. Серия недавно проведенных экспериментов, аналогичных тем, результаты которых изображены на рис. 4.4, показала возможность перехода адсорбированной формы белка (коэффициент распределения близок к 1) в неадсорбированную (коэффициент распределения равен 0)
pH Число зарядов ( : )
А Б
Рис. 4.7. А. Изменение значения а в зависимости от pH для сорбированной на КМ-целлюлозе фосфоглицераткиназы из дрожжей. 1 = 0,01 (непрерывная линия). Значения Кр (прерывистая линия) были рассчитаны из уравнения (4.6). Б. Зависимость log Кр от числа зарядов на молекуле фермента, рассчитанная из кривой титрования и изоэлектрической точки, равной 7,1. Значение 5 (см. текст) равно 0,4.
104
Глава 4
при изменении pH буфера [38]. Расчеты, сделанные на основе этих кривых и уравнений, приведенных в разд. 4.1, позволяют количественно оценить величины констант диссоциации (допуская, что условия приближаются к равновесным) между белком и адсорбентом. В этих работах в качестве адсорбента была использована КМ-целлюлоза. Оказалось возможным не только рассчитать величины а и Кр, но исходя из скорости изменения этих величин в зависимости от pH получить величину энергии взаимодейст-вия в расчете на единичный заряд белка. (Практически это скорость повышения энергии взаимодействия в расчете на каждый дополнительный положительный заряд, так как асимметрия в распределении зарядов и отсутствие данных о точных значениях изоэлектрических точек создает трудности при установлении точного числа зарядов белковой молекулы, участвующих во взаимодействии с адсорбентом.) Вывод уравнений, связывающих эти параметры, представлен ниже, а также на рис. 4.7.
Исходя из кривой рН-титрования и зная изоэлектрическую точку, можно подсчитать число зарядов на молекуле при каждом значении pH. Построение графика зависимости log Кр от числа зарядов на белковой молекуле (z) дает прямую, наклон которой (см. рис. 4.7) равен
s = (d \cgKp)/dz.
Энергия взаимодействия в расчете на 1 моль составляет AGO — —2.3RT log КР.
Следовательно, скорость изменения энергии взаимодействия на
Предыдущая << 1 .. 34 35 36 37 38 39 < 40 > 41 42 43 44 45 46 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed