Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Из графика, приведенного на рис. 4.4, можно подсчитать, что измеренные средние величины Кр изменяются приблизительно в 5 раз по мере того, как степень насыщения центров связывания изменяется от очень низких значений до 50%. Величи-
Рис. 4.5. Ожидаемый профиль элюции альдолазы кролика в условиях постоянного состава буфера при pH 7,5 (использованы данные, представленные на рис. 4.4). Появление длинного «хвоста» объясняется повышением величины а в процессе разбавления белка.
7*
100
Глава 4
на nit для всех доступных центров связывания не может быть одной и той же в разных условиях. Общая эффективная емкость ионообменника значительно увеличивается при очень прочном связывании и уменьшается при слабом, хотя структура и распределение центров связывания зависят только от адсорбента. Если белок имеет суммарный заряд, равный 50, то он может связаться со «слабым» центром; если же )этот заряд равен 30, то никакого заметного взаимодействия может и не наблюдаться.^
Другое "существенное осложнение состоит в том, что некоторая часть адсорбционных центров медленно связывается с белком. Иногда эта зависимость от времени такова, что для полного насыщения может потребоваться не менее часа. Ясно, что в этих случаях подход, основанный на равновесии, неприменим. Такие труднодоступные центры связываются с белком в процессе длительного нанесения его на колонку. Если нанесение белка на колонку занимает много времени, то обычно много времени требуется и для выхода белка из колонки. Таким образом, при быстрой элюции какое-то количество фермента остается на колонке и элюируется позже, что вызывает размывание задней границы белковой зоны (образование «хвоста»). Это явление уже обсуждалось выше в рамках представлений о равновесии при анализе коэффициентов распределения и изменения констант диссоциации. Некоторые белки могут остаться на колонке, особенно если при изменении состава буфера происходит сжатие адсорбента, что в конце концов приводит к захватыванию белка в труднодоступном центре связывания.
Последнее осложнение, нарушающее теоретические предсказания, связано с негомогенностью адсорбента; несомненно, это основной фактор, от которого зависят величины Кр, но это означает также, что концентрация центров связывания тпх [уравнение (4.2)] является усредненной величиной, так как ее подсчитывают исходя из концентрации связанного белка. В некоторых адсорбентах большой объем носителя очень слабо модифицирован, так что число эффективных центров связывания здесь незначительно, но там, где произошла модификация адсорбента, это число настолько велико, что практически весь связанный белок остается в этой относительно небольшой часта общего объема адсорбента. Следовательно, истинная эффективная величина в уравнении (4.5) может быть намного выше, чем среднее ее значение, подсчитанное исходя из связывания белка на 1 см3 адсорбента. Это приведет к повышению величины а по сравнению с тем, что наблюдается, когда центры связывания распределены в матрице равномерно. Далее этот вопрос будет обсуждаться при описании аффинной адсорбции (разд. 4.5).
Разделение белков путем адсорбции
101
Резюмируя вышеизложенное, можно сказать, что использование константы диссоциации при описании адсорбционных эффектов в процессе сорбции белков носителем может быть полезным, если иметь в виду, что в большинстве случаев не существует какой-то одной величины константы диссоциации, а усредненная величина меняется в зависимости от степени насыщения центров связывания. Аналогично коэффициент распределения, являющийся важным экспериментальным параметром, может снижаться как непосредственно по мере приближения к состоянию насыщения, так и опосредованно, в результате того, что увеличение числа занятых центров приводит в среднем к снижению сродства, т. е. к снижению величины а.
4.2. ИОНООБМЕННИКИ: ПРИНЦИПЫ, СВОЙСТВА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
Хотя предыдущий раздел посвящен общим принципам хроматографии, в нем часто упоминаются ионообменники, и многие теоретические положения были проверены именно на ионообменных адсорбентах. Белки связываются ионообменником в основном с помощью электростатических сил между заряженными поверхностями белков и плотными кластерами заряженных групп на ионообменнике. Степень модификации типичной диэтил аминоэтил (ДЭАЭ)целлюлозы или карбоксиметил (КМ) целлюлозы может быть достаточно высока — до 0,5 ммоль *см~3 (для набухшего адсорбента в колонке), что соответствует0,5М концентрации заряженных групп. Заряды, конечно, нейтрализованы противоионами (ионами противоположного знака), такими, как ионы металлов, хлорид-ионы и иногда ионы буфера. Белок должен вытеснить противоионы и связаться с матрицей. Обычно суммарный заряд на белке имеет тот же знак, что и вытесняемые противоионы, отсюда происходит термин «ионный обмен». Молекулы белка в растворе также нейтрализуются ионами противоположного знака; суммарный эффект сводится к тому, что данная область адсорбента становится электрически нейтральной. Это явление иллюстрирует рис. 4.6. Здесь представлена ситуация, когда отрицательно заряженный белок предварительно уравновешен буфером трис-С1; таким образом, с белком соединяют ионы Н-трис+ Адсорбент же (ДЭАЭ-целлюло-за), также уравновешенный буфером, несет на себе противоионы С1~.
