Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
т-р (mt — д)р
mtP KlP /Л 7\
q(KP + p) = mtp, q= ^+~- или , + ^ . (4.7)
Это и есть уравнение изотермы Ленгмюра. Следует отметить, что р — это концентрация свободного белка в состоянии равновесия, а не общая его концентрация. Изотерма Ленгмюра, таким образом, не связывает, как это иногда думают, количество адсорбированного белка с количеством внесенного белка. Величину р намного труднее измерить, чем величину pt.
На рис. 4.2 изотерма Ленгмюра сравнивается с отношением количества адсорбированного к количеству внесенного белка и с величиной а.
Для методов колоночной хроматографии характерно использование относительно больших образцов, объем которых часто намного превышает объем колонки. Применяются буферные растворы, подобранные так, чтобы адсорбировался нужный белок. С самого начала судьба белка может быть различна; при этом возможны три варианта. Белок либо полностью адсорбируется и не перемещается по колонке (<х = 1), либо совсем не адсорбируется (а = 0), либо адсорбируется частично (0<а<1), перемещается по колонке и выходит из нее, когда с момента его
Разделение белков путем адсорбции
97
>4 б
Рис. 4.2. А. Изотерма Ленгмюра, показывающая процентное содержание насыщенных центров (количество адсорбированного вещества) в зависимости от концентрации свободного вещества. Б. Степень насыщения (сплошная линия) и коэффициент распределения (прерывистая линия) в зависимости от полного количества добавленного вещества.
нанесения через колонку проходит объем жидкости, равный 1/(1—а) объема колонки. Так, если объем нанесенного образца в 5 раз превышает объем колонки и колонку промывают еще 5 объемами буфера, то для того, чтобы данный белок остался на колонке, значение а должно быть больше 0,9. С другой стороны, если а=0,4 и на колонку наносят небольшой объем образца, то можно реализовать очень удобный способ очистки (рис. 4.3). Как будет показано ниже, величина а очень быстро изменяется при малейших изменениях условий, поэтому мало вероятно, что какой-то другой белок будет иметь ту же промежуточную величину а. Если у интересующего нас белка вели-
^ Объем элюата (за единицу принят объем колонки) 7—1078
Рис. 4.3. Идеализированная кривая, отражающая поведение смеси белков с а=0 и одного белка с а = 0,4. Белки с а—0 выходят в объеме элюата, равном одному объему колонки. Белок с а = 0,4 выходит в объеме, равном 1 / (1—а) = 1,7 объемов колонки (заштрихованный пик). Для нанесения и элюции белков используют один и тот же буфер.
98
Глава 4
чина а равна нулю или немного больше нуля, то он проходит через колонку вместе со всеми другими белками, у которых величина а равна нулю. Это можно использовать в качестве одного из этапов очистки, особенно если основная масса белков остается сорбированной на колонке. В этом случае принципы хроматографии неприменимы и процесс основан на том, что белки с высокими, но не равными единице величинами а полностью адсорбируются на колонке. Такой процесс невозможен при адсорбции «цз объема» (разд. 4.9). Если фермент находится во фракции,-содержащей неадсорбированные белки, его можно получить очень быстро и со 100%-ным выходом, так как для этого не нужно использовать какую-то схему элюции. Фермент будет также, по всей вероятности, растворен в буфере с низкой ионной силой, в котором его можно сразу же нанести и адсорбировать на хроматографической колонке другого типа. Таким образом, хотя все возможности хроматографии полностью используются только после адсорбции на колонке всего фермента (а>0,8) и последующей элюции его путем смены буферных растворов по определенной схеме, по крайней мере его частичной очистки удается добиться и при других условиях.
Даже если все центры адсорбции эквивалентны, величина а зависит от концентрации белка [см. уравнение (4.5) г рис. 4.2, ?], причем при более высокой его концентрации адсорбируется меньшая доля (хотя и большее количество) белка. Тот факт, что на самом деле существует целый ряд величин Кр> только усиливает этот эффект. В первую очередь белок занимает более сильные центры связывания (низкое значение Кр); при высокой концентрации белка требуется большее число более слабых центров связывания, что приводит к более высокому среднему значению Кр и более низкому а. В литературе при-
0,25 0,5 0,75 1,0 Отношение
Рис. 4.4, Зависимость величины а от концентрации белка для альдолазы из мышц кролика, адсорбированной на КМ-целлюлозе при различных значениях pH. (Экспериментальные данные из работы Ско-упса [38].)
Разделение белков путем адсорбции
99
водятся некоторые количественные параметры адсорбции аль-долазы из мышц кролика на КМ-целлюлозе [38]. На рис. 4.4 эти результаты представлены в виде кривых изменения величины а в зависимости от общего количества белка при четырех различных значениях pH. При pH 7,5 концентрация общего белка в середине зоны альдолазы на колонке будет приближаться к ти а величина а будет приблизительно равна 0,6—0,7. Любой белок, двигающийся впереди основной зоны, благодаря диффузии или неравномерности потока через колонку разбавляется, и величина а повышается. В этом случае если р*//п* = 0,1, то а = 0,9. Следовательно, этот белок большей частью адсорбируется и задерживается по отношению к основной зоне. В результате наблюдается эффект сужения (концентрирования) на передней границе белковой зоны. Однако понижение концентрации белка на задней границе приводит к постоянному увеличению силы связывания. Теперь а приближается к 0,9, так что задняя граница белковой зоны двигается со скоростью, составляющей только 10% скорости потока буфера, тогда как скорость движения основной зоны соответствует 30—40% скорости потока. В итоге при постоянном составе буфера фермент элюируется с колонки в виде пика с резкой передней границей, содержащей высокую концентрацию белка, но с очень длинным «хвостом» (рис. 4.5). Такая картина часто наблюдается при использовании ионообменников; однако эту трудность можно преодолеть, используя буферные градиенты (разд. 4.3).
