Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
(4 1)
Для того чтобы правильно определить члены этого уравнения, нужно уточнить объем, занимаемый данным количеством носителя; определение будет разумным, если допустить, что адсорбент имеет объем, равный объему, который он занимает в колонке. В этих условиях типичный современный адсорбент на основе целлюлозы или агарозы имел бы эффективный жидкостный объем (Ve)1*, составляющий 75—90% общего объема (Vt), а адсорбент плюс связанная вода занимали бы остальное пространство. Таким образом, количество белка в свободном растворе, окружающем адсорбент, несколько меньше, чем его концентрация, умноженная на общий объем.
Определив эту константу диссоциации, мы теперь можем использовать ее наиболее удобным для адсорбционной хроматографии способом. Адсорбция представляет собой распределение растворенного вещества (белка) между двумя фазами — жидкой и твердой. Коэффициент распределения можно определить
1 Ve — «свободный объем», как он определяется в теории гель-фильтрации, т. е. объем, доступный макромолекулам и зависящий от размера белка.
Разделение белков путем адсорбции
95
как количество адсорбированного в данный момент растворенного вещества, отнесенное к полному его количеству. Он может быть также определен как доля растворенного вещества в растворе, и в этом смысле коэффициент распределения идентичен Rf — подвижности раство|ренного вещества относительно фронта буфера. Здесь будет использовано первое определение. Коэффициент распределения обозначается а (та = 1—/7), и в этой главе мы будем очень часто обращаться к данной величине. Следует отметить, что когда говорят о низких значениях а, то подразумевают значения от 0 до примерно 0,5; высокие же значения — это значения, близкие к единице.
Взаимосвязь между а и Кр может быть определена следующим образом.
Пусть общая эффективная концентрация центров адсорбции (т. е. их способность адсорбировать тот белок, о котором идет речь) будет mi. Допустим, что общая концентрация белка (свободный+связанный) на адсорбенте равна pt, тогда
Подставляя в уравнение (4.1) значения q, т и р, определенные из уравнений (4.2), (4.3) и (4.4), получаем
{щ — Pi a) (Pt — Р«а) (m( — pt а) (1 — а)
ЛР — n.rt. = п.
Таким образом, а — это корень квадратного уравнения, значения которого лежат в пределах от 0 до 1. Следует отметить, что в условиях, когда например когда число центров связывания намного больше,
чем количество белка, которое нужно связать, имеем
Теперь величину а можно очень просто определить экспериментальным путем; в определенных условиях pt и mt легко измерить и таким образом экспериментально проверить обоснованность приведенных аргументов, а также определить величины Кр. Концентрация эффективных центров связывания обычно варьирует от 0,01 мМ для аффинных адсорбентов до 1 мМ1 и более для ионообменников. В тех же пределах будут
гщ — т + д, pt = p + q,
(4.2)
(4.3)
(4.4).
pt а
отсюда
Pi а2 — а (mi + Р* + Кр) -|- /я* — 0.
(4.5>
т~ти q = pta и р= pt — q = pt (1 — а);
следовательно,
mt-(1 — ос)
(4.6)
а
1 Эта величина сильно зависит от размеров молекулы белка; см. табл. 4.3.
96 Глава 4
Таблица 4.1. Решение уравнения ptd2- -a(mt+pt+Kp)+mt= 0 относительно а
КР, ММ Pt, мМ. гг мМ а Кр* мМ pf, мМ т^, мМ а
0,1 0,1 1,0 0,90 1,0 0,01 1,0 0,50
0,1 0,5 1,0 0,85 0,1 0,1 10 0,99
0,1 1,0 1,0 0,73 1,0 0,1 10 0,99
0,1 0,1 0,1 0,38 0,1 0,1 0,2 0,59
0,1 0,5 0,1 0,16 0,1 0,1 0,5 0,81
0,1 0,01 1,0 0,91 0,1 0,1 2 0,95
0,01 -0,01 1,0 0,99 0,1 0,1 5 0,98
0,01 0,5 1,0 0,98
лежать и величины общей концентрации белка. В табл. 4.1 представлены параметры уравнения (4.5) при различных величинах /Ср. Для того чтобы на хроматографической колонке происходила приемлемая адсорбция» нужно, чтобы величина а была равна по крайней мере 0,8, откуда следует, что величина Кр, как правило, должна быть меньше 0,1 мМ. Что касается аффинных адсорбентов, то для них могут быть существенные отклонения.
Обычно при описании хроматографических процессов используют изотерму Ленгмюра, которая выражает количество связанного белка (<?) через концентрацию свободного белка в растворе (р). Используя символы, приведенные выше, это выражение можно вывести из значения константы диссоциации Kpi
