Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
92
Глава 4
рию хроматографии белков; это особенно полезно при описа-нии аффинных методов.
Требования к белковым адсорбентам значительно отличаются от требований, предъявляемых к адсорбентам низкомолекулярных соединений. Структура адсорбента должна быть рыхлой, с тем чтобы белок мог проникнуть внутрь частиц и достичь центров связывания. Если же адсорбент имеет более плотную структуру, то для связывания с белком доступно лишь небольшое число^ Центров связывания на поверхности частицы, и емкость адсорбента значительно снижается. Кроме того, адсорбент по своей природе не должен оказывать вредного влияния на белки. Основной материал матрицы не должен сильно взаимодействовать с белком — адсорбционная способность обычно создается путем присоединения заместителей к предположительно инертной основе. Оба этих фактора делают стандартные типы ионообменных адсорбентов низкомолекулярных соединений неприемлемыми для работы с белками. Замещенные полисти-рольные смолы с большим числом сшивок не пропускают белки внутрь частиц. На их поверхности есть как гидрофобные, так и ионные группы, которые связываются с белком и затрудняют его элюцию. При большой плотности заряженных групп белок может связаться с адсорбентом практически необратимо. Считается, что сильно кислые заместители, например сульфогруп-пы, или сильно основные вредны, однако это терминологическая путаница: заряженная форма, используемая в ионном обмене* является сопряженным слабым основанием (например, сульфо-группы) или слабой кислотой (например, четвертичное аммониевое основание).
Первыми материалами, успешно использованными в колоночной хроматографии белков, были ионообменники на основе целлюлозы, разработанные Петерсоном и Собером [37]. Для сорбции из объема применялись также многие другие адсорбенты, но только некоторые из них пригодны для работы на колонке из-за плохих характеристик потока. Обработанный должным образом порошок целлюлозы приобретает пористую структуру, позволяющую белкам проникать внутрь частиц. Более того, модификация целлюлозы заряженными группами увеличивает и стабилизирует пористость структуры в результате взаимного отталкивания зарядов. Такие материалы оказались идеальными для ионообменной хроматографии белков, и до сих пор это наиболее широко используемые адсорбенты. Другие важные адсорбенты, применяемые для работы на колонке, также представляют собой главным образом адсорбенты на основе биополимеров— декс^ранов или агароз. Сюда входят многие истинно аффинные и модифицированные красителями «псевдоаффинные» адсорбенты, гидрофобные адсорбенты и некоторые ионообмен-
Разделение белков путем адсорбции
93
ные материалы. Единственным исключением является кристаллическая форма фосфата кальция (гидроксилапатит), который можно использовать для колоночной хроматографии; более же традиционный кальцийфосфатный гель не годится для набивки1 колонок. Теория хроматографии, изложенная ниже, применима ко всем этим адсорбентам, используемым как в колоночном варианте, так и при адсорбции «из объема».
При взаимодействии белка с адсорбентом редко возникает какое-то одно соединение, подобное тому, которое образуется при связывании фермента с его субстратом. На носителе имеется множество центров связывания различной конфигурации для белков, которые сами могут иметь олигомерную четвертичную структуру и потому способны связываться с носителем в нескольких местах на его поверхности. На рис, 4.1 представлено плоскостное изображение того, каким образом молекулы белка могут распределяться в адсорбенте с беспорядочным расположением центров связывания. Белок может взаимодействовать с двумя, тремя или большим числом центров, что приводит к полидисперсности сил взаимодействия. Знаки « + » на рисунке означают, что это анионообменник. Однако на диаграмме можно представить и многие другие типы адсорбентов. Поэтому
Константа диссоциации при взаимодействии белка с матрицей
(+) на ионообменнике. Заряженные группы распределены беспорядочно
мя, четырьмя и пятью положительными зарядами
Рис. 4.1. Двумерное изображение полидисперсности адсорбционных центров в
ионообменнике. Показано, что молекулы белка могут
или гетеродисперсно из-за негомогенности адсорбента.
взаимодействовать с тре-
-Ь
<94
Глава 4
вполне вероятно появление целого набора всевозможных «констант диссоциации», распределение которых не обязательно будет равномерным. Есть ли возможность усреднить эти величины и использовать одну цифру, которая будет характеризовать взаимодействие большинства молекул? Если нет, то математические сложности и необходимость знать функцию распределения констант сделает это приближение практически невозможным. К счастью, в большинстве случаев можно использовать одну «кажущуюся» константу диссоциации. Отклонение от идеального поведения из-за такого приближения можно объяснить если не математически, то описательно.
Эксперименты, проведенные с ионообменниками, указывают -на то, что связывание в основном может быть описано одной константой диссоциации, что делает этот подход полезным и даже почти количественным [29, 38]. Если мы обозначим концентрацию белка в свободном растворе, находящемся в равновесии с адсорбентом, через р, концентрацию свободных эффективных центров связывания через т (эффективными центрами связывания считаются такие, которые белок может занять без стерических препятствий со стороны соседних связанных белков и сродство которых к белку достаточно высоко, чтобы эффект •был наблюдаем), концентрацию белка, связанного с носителем, через qt тогда константу диссоциации для взаимодействия белка с носителем Кр можно определить следующим образом:
