Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 35

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 145 >> Следующая

В основе принципа лежит разная чувствительность белков к воздействию органических растворителей. Некоторые белки удивительно стабильны, и это их свойство можно использовать, подвергая денатурации другие, менее стабильные белки. В качестве примера можно назвать креатинкиназу из мышц кролика, стабильную в щелочной среде при концентрации этанола до 60% (по объему) и температуре 25°С; это свойство использова-
Концентрация спирта, % по объему
Рис. 3.17. Денатурация глицеральдегидфосфатдегидрогеназы дрожжей под действием различных спиртов. Фермент в концентрации 2 мг-мл"1 инкубировали при 30 °С в течение 30 мин, охлаждали и удаляли осадок центрифугированием. В надосадочной жидкости определяли оставшуюся ферментативную активность. Обозначения: / — метанол; 2 — этанол; 3 — пропан-2-ол;
4 — пропан-1-ол; 5 — бутан-1-ол; 6 — пентан-1-ол. (Неопубликованные результаты автора.)
90
Глава 3
ли для проведения одной из стадий первоначального способа очистки этого фермента [34]. Алкогольдегидрогеназу дрожжей можно очень легко очистить после предварительной обработки экстракта 33%-ным (по объему) этанолом при 25°С [35].
Было исследовано действие спиртов на глицеральдегидфос-фатдегидрогеназу дрожжей (неопубликованные данные). Выяснилось, что чем длиннее алифатическая цепь использованного спирта, тем более сильным денатурирующим действием он обладает (рис. 3.17). Концентрация нормального спирта, необходимого для достижения 50%-ной денатурации за время 30-минутной инкубации при 30 °С, снижается в 2 раза при удлинении цепи спирта на одну метиленовую группу. Так, процентная концентрация метанола, этанола, пропан-1-ола, бутан-1-ола, пентан-1-ола, необходимая для денатурации, равна соответственно 34, 17, 8,5, 4,2 и 2,2. Ряд не был продолжен далее из-за того, что спирты с более длинной цепью плохо смешиваются с водой. Спирты с разветвленной цепью обладают меньшим денатурирующим действием (и лучше смешиваются с водой), откуда следует, что важной характеристикой денатурирующих свойств спирта является длина его алифатической цепи. Ацетон дает результаты, сходные с результатами, полученными при обработке этанолом. Итак, чтобы избежать денатурации при осаждении органическими растворителями, лучше использовать метанол.
Для денатурации органическим растворителем необходимо очень тщательно подбирать pH и температурный режим, так как эти три фактора оказывают совместное действие на белки. Поскольку существует множество различных вариантов, практически невозможно добиться идеальных условий проведения процесса, т. е. таких, при которых максимальное сохранение активности нужного фермента сочеталось бы с максимальным разрушением других белков. С другой стороны, для подбора условий, близких к оптимальным, можно провести много пробных тестов за короткое время с малыми объемами образца.
Часто приводимым примером осаждения белка органическим растворителем, но на этот раз не смешивающимся с водой, является денатурация гемоглобина хлороформом (ср. [7] и, например [36]). Очистка ферментов эритроцитов осложняется тем, что более 90% общего белка эритроцитов составляет гемоглобин. Встряхивание гемолизата со смесью этанол — хлороформ приводит к полной денатурации гемоглобина. Незначительное количество хлороформа смешивается с водной фазой и оказывает сильное специфическое денатурирующее действие на молекулы гемоглобина. Таким образом, первой стадией выделения эритроцитарного фермента часто служит обработка гемолизата хлороформом, что приводит к удалению основного загрязняющего белка — гемоглобина.
ГЛАВА 4
РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПУТЕМ АДСОРБЦИИ
Белки обычно избирательно адсорбируются на твердых фазах самых разных типов. Поэтому адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография, широко используются для разделения белков. Применение таких методов часто позволяет получить наибольшую степень очистки белков, что в случае ферментов означает максимально возможное повышение их удельной активности. Хотя колоночная хроматография служит идеальным способом оптимального разделения белков, не следует забывать и о методах адсорбции «в объеме», так как это очень быстрые и потому весьма полезные методы, когда время имеет первостепенное значение (см. также гл. 7). Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники, фосфат кальция (в виде геля или в кристаллической форме) и разнообразные аффинные адсорбенты, созданные для ферментов определенных типов. Все эти вопросы вслед за общим введением в теорию адсорбционной хроматографии обсуждаются в данной главе применительно к выделению белков.
4.1. ТЕОРИЯ ХРОМАТОГРАФИИ БЕЛКОВ
Теория хроматографии была разработана для низкомолекулярных соединений, и многие ее понятия и принципы не всегда подходят для описания взаимодействий белков и их поведения на адсорбентах. Среди особенностей, характерных для разделения высокомолекулярных полимеров, следует отметить такие, как ситовой эффект матрицы, большую разницу в силах взаимодействия белка с различными частями адсорбента и нередко высокую адсорбционную емкость адсорбентов (в г-см~3, хотя в молях она имеет обманчиво низкую величину). Биохимики привыкли воспринимать молекулярные взаимодействия в терминах констант диссоциации, которые часто можно соотнести с величинами Км в ферментативной кинетике. Применяя ту же концепцию констант диссоциации к процессу взаимодействия между белком и адсорбентом, можно разработать простую тео-
Предыдущая << 1 .. 29 30 31 32 33 34 < 35 > 36 37 38 39 40 41 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed