Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 33

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 27 28 29 30 31 32 < 33 > 34 35 36 37 38 39 .. 145 >> Следующая

Большая величина Ег^(АН^) в приведенном уравнении — это именно то, что отличает тепловую денатурацию белков от обычных химических процессов. Поэтому с изменением температуры скорость денатурации изменяется очень быстро. Величину Д?/Ф можно рассчитать на основе теории абсолютных скоростей реакций. При скорости денатурации в пределах 10~4—10~2 с-1 величина ДСФ составляет около 80 кДжХ Хмоль-1. Так как АН Ф«ДОФ +ГА5Ф, а величина ДЯФ обычно лежит в пределах 300—500 кДж-моль-1, из этого следует, что AS* имеет необычно большую величину, лежащую между 200 и 1000 Дж'Град_1Х Хмоль-1. Этот факт имеет очень простое объяснение. В начале денатурации происходит разрыв множества связей, значительные конформаци-онные перестройки белка и высвобождение ассоциированных молекул растворителя, что сопровождается увеличением энтропии, т. е. возрастанием степени неупорядоченности. Величина AS0 для процесса денатурации в целом, при полной неупорядоченности полипептидных цепей, может составлять несколько тысяч Дж-град-1-моль-1. Процесс денатурации может включать несколько стадий, идущих по различным альтернативным путям, однако для описания всего процесса в целом с точки зрения термодинамики необходимо знать только величину энергии активации самой медленной стадии. Такой стадией обычно является первая стадия процесса.
40 45 50 55
Температура,0 С
Рис. 3.14. Теоретическая кривая, показывающая количество белка, оставшегося неденатурированным после 10-мин инкубации. ?акт=400 кДж * моль-1; 50%-ная денатурация происходит при 50 °С. Предполагается, что процесс необратим.
Разделение белков путем осаждения
85
На рис. 3.14 представлена теоретическая кривая, позволяющая определить количество белка, денатурировавшего за 10 мин при данной температуре. Кривая построена в предположении, что ?'аКт=400 кДжХ Хмоль-1 и что 50%-ная денатурация наступает через 10 мин при 50 °С. Следует отметить, что при температуре лишь на 5 °С выше температуры, соответствующей 50%-ной денатурации, сохраняется не более 1% исходной активности, а при температуре на 5°С ниже указанной утрачивается только 8% активности.
Разные белки имеют неодинаковую величину Егкт, и, следовательно, средние точки их кривых денатурации (а также форма кривых) сильно различаются. Поэтому можно подобрать температуру, при которой один белок полностью денатурирует, тогда как другой белок более чем на 95% остается интактным. В группе белков, показанной на рис. 3.15, каждый белок имеет собственную кривую денатурации. Если в этом случае попытаться выделить белок D путем нагревания смеси до 50 °С в течение 10 мин, то белки А и В денатурируют практически полностью, а белок С — лишь в незначительной степени. Белок D сохраняется на 90%, тогда как белки Е и F совсем не подвергаются денатурации. В зависимости от соотношения данных белков в обрабатываемой смеси этот этап может иметь определенный смысл, особенно если другим способом трудно отделить А или В от D.
Рис. 3.15. Возможные кривые денатурации для набора белков. F — самый устойчивый к нагреванию белок; А и В — наименее устойчивые белки (см. текст).
86
Глава 3
Так же как и в случае многих других эмпирических методов фракционирования, весьма маловероятно, чтобы исследователь, применяющий тепловую денатурацию белков, имел хоть какое-то представление о поведении многих, если не всех, белков, присутствующих в смеси, не говоря уж о таких подробных сведениях, которые даны на рис. 3.15. Однако о поведении определенного интересующего иследователя фермента можно судить, нагревая небольшие пробы при различных температурах с интервалами в 5°С. Время инкубации важно только для получения воспроизводимых результатов; инкубация проб в течение 1 или 60 мин даст кривые одинаковой формы, но сдвинутые по оси температур. Тем не менее следует учитывать, что если инкубация в течение 1 мин очень удобна при работе с объемом 1 мл, то почти невозможно за такое короткое время нагреть и быстро охладить большой объем жидкости. Во время нагревания раствора до нужной температуры и последующего ее снижения происходит дальнейшая денатурация.
Говоря о тепловой денатурации, важно обратить внимание на возможность протеолиза. Протеазы, как и другие ферменты, активируются при повышении температуры. Они обычно довольно стабильны, так что даже в том случае, когда нужный фермент сохраняет активность, вполне может произойти частичное расщепление белка или его небольшая модификация, что неблагоприятно скажется на качестве препарата. Именно по этой причине предпочтительно проводить нагревание в присутствии сульфата аммония (несмотря на то что под влиянием соли белки могут стабилизироваться настолько, что для их денатурации потребуется более высокая температура), поскольку высокие концентрации соли в значительной мере ингибируют протеолиз. Есть также примеры стабилизации фермента его субстратом, однако присутствие субстрата может также и дестабилизировать фермент.
Для получения воспроизводимых результатов необходимо тщательно контролировать состав буфера, содержащего подвергаемый тепловой обработке образец. Температурная кривая денатурации должна быть воспроизводимой. Помимо всего прочего, необходимо точно знать pH раствора. Как показано в следующем подразделе, незначительное изменение pH может быть, причиной существенной денатурации белка.
Предыдущая << 1 .. 27 28 29 30 31 32 < 33 > 34 35 36 37 38 39 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed