Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
ПЭГ значительно труднее удаляется из белковой фракции, чем соль или органический растворитель. Из-за его полимерной природы он очень медленно диализуется. Разделение на обычной колонке с сефадексом G-25 также не дает хороших результатов, особенно в случае ПЭГ с мол. массой 20000. Тем не менее остаточные низкие концентрации ПЭГ не мешают проведению многих процедур — высаливание, ионообменную и аффинную хроматографии или гель-фильтрацию можно проводить, не удаляя предварительно ПЭГ.
При очистке белков, особенно в промышленности, используют также заряженные полимеры (полиэлектролиты) [30, 33]. Они привлекательны своей дешевизной, а также тем, что при их применении не возникает трудностей, связанных с удалением отходов, поскольку осаждение белков происходит при очень низких концентрациях полимеров — 0,05—0,1 (вес/объем). Использование заряженных полимеров ограничено только специфическими случаями, что обусловлено способом осаждения белков. Электростатические комплексы между солями полиакриловой кислоты и положительно заряженными белками образуются при низких значениях pH, обычно в пределах от 3 до 6. Многие ферменты не выдерживают таких низких значений pH. Более того, величина положительного заряда многих ферментов мала даже при значениях pH, соответствующих нижней границе указанной области. Стернберг и Хершберг [33] описали осаждение различных белков как линейными, так и поперечно-сшитыми полиакрилатами. Основные белки, такие, как лизоцим, цитохромы, протамины и трипсин, осаждались хорошо, хотя при pH 3,5 осаждался также и пепсин, отрицательно заряженный при этом pH. Вполне вероятно, что положительно заряженные полимеры, подобные ДЭАЭ-декстрану, будут эффективными осадителями кислых белков при более высоких значениях pH.
Среди других осадителей следует назвать соли каприловой кислоты («-октановой кислоты) и риванол (2-этокси-6,9-диами-ноакридинлактат), которые применяются в основном для фракционирования белков плазмы [30]. Вероятно, существует огромное множество других органических соединений, имеющих как гидрофобные, так и полярные свойства. Они также могут использоваться для осаждения, но способы их применения практически не изучены.
Разделение белков путем осаждения
8?
3.6. ОСАЖДЕНИЕ ВСЛЕДСТВИЕ ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ДЕНАТУРАЦИИ
Основные принципы
На всем протяжении этой книги неоднократно подчеркивается, что во избежание денатурации белков следует использовать мягкие способы их обработки. Существует целый ряд. очень устойчивых ферментов, выдерживающих экстремальные условия окружающей среды. Эту исключительно высокую стабильность можно использовать, подвергая неочищенный препарат воздействию таких условий. При этом ненужные белки денатурируют и выпадают из раствора в осадок. В процессе денатурации происходит разрушение третичной структуры белковой молекулы и образуются неупорядоченные полипептидные цепи. В растворе они взаимодействуют между собой и агрегируют. Агрегация происходит под действием физических сил и в некоторой степени в результате химических взаимодействий через образование —S—S-связей. Тем не менее при низких концентрациях солей и значениях pH, далеких от изоэлектрической точки, денатурированные белки могут находиться в полностью растворимом состоянии и осаждаться только при достижении определенного значения pH. Растворимость денатурированных белков может быть обусловлена силами отталкивания между отдельными заряженными пептидными цепями. По мере приближения pH к изоэлектрической точке белки могут претерпевать агрегацию, которой способствует также высокая концентрация соли, снижающая внутримолекулярные силы отталкивания.
Цель избирательной денатурации состоит в создании таких условий, при которых нужный фермент или совсем не денатурирует, или же потери его составляют не более 10—20%, тогда как множество других компонентов смеси денатурирует и в основном осаждается в результате проведенной обработки. Для избирательной денатурации используют преимущественно 1) температуру, 2) pH и 3) органические растворители. Эти три способа воздействия обычно взаимосвязаны, поскольку денатурация под действием температуры в большой степени зависит от значений pH, и наоборот. При денатурации органическими растворителями необходимо тщательно подбирать температуру, pH и величину ионной силы. Ионная сила может несколько изменять влияние температуры и pH, особенно если сравнивать поведение белков при низкой ионной силе (от 0,01 до 0,1) с их поведением при высокой концентрации соли, например в 1 М растворе сульфата аммония. Эти три типа денатурации рассматриваются ниже.
6*
Количество неденатурированного белка, %
Глава 3
Денатурация под действием температуры
Тепловую денатурацию белка можно представить как реакцию первого порядка с константой скорости, подчиняющейся обычным законам термодинамики. Так, константа скорости &ден связана с температурой следующим уравнением:
d In &ден __ ?*акт dT — RT2 ¦
где ?акт — энергия активации, равная ЛЯФ +RT, а ДЯ+—энтальпия активации
