Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 31

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 145 >> Следующая

80
Глава 3
творителя можно удалить, поместив раствор в бюхнеровскую колбу и выпарив его при пониженном. давлении. Температуру можно поднять до 25—30 °С, погрузив колбу в процессе выпаривания в теплую воду, однако некоторые растворы сильно пенятся, вследствие чего этот метод не всегда дает удовлетворительные результаты. Наилучшим способом удаления следов органического растворителя, а также других низкомолекулярных соединений, которые могут осаждаться вместе с белком, является гель-фильтрация на колонке, подходящей для данного объема образца (табл. 1.2).
К надосадочной жидкости, полученной в результате первого осаждения органическим растворителем, добавляют еще одну порцию растворителя для осуществления следующего этапа фракционирования. Количество органического растворителя, которое необходимо добавить, можно рассчитать по формуле
1000 (и — х)
V = - 100-у мл>
где v — объем растворителя, добавляемый к 1 л раствора, содержащего х% растворителя, чтобы получить у%-ный раствор.
В приложении А (табл. II) приведены количества чистого растворителя, которые следует добавить для получения растворов с различной концентрацией растворителя.
При 50%-ной концентрации растворителя в растворе, вероятно, останутся только белки с молекулярной массой менее 15000. Осаждению кислых белков способствует присутствие в растворе ионов двухвалентных металлов, таких, как магний; у образовавшихся магний-белковых комплексов величина суммарного заряда меньше, что облегчает агрегацию. Наоборот, изменение pH в сторону изоэлектрической точки может привести к осаждению белка и без увеличения концентрации органического растворителя. Следует отметить, что значение pH, измеренное с помощью электрода, стандартизованного по водному буферу, обычно повышается по мере повышения концентрации органического растворителя. Это объясняется просто тем, что диссоциация кислоты складывается из двух процессов:
НА —Н++А\
Н" + Н20 = Н30+.
На второй процесс влияет снижение активности воды в присутствии органического растворителя. Ка для всего процесса в целом оказывается меньше (рКа возрастает). В качестве примера можно привести данные, полученные при выделении препарата фосфофруктокиназы из дрожжей [17]. В этой работе pH экстракта доводили до 6,0, затем добавляли ацетон до концентра-
Разделение белков путем осаждения
81
ции 23% по объему и удаляли осадок; значение pH надосадоч-ной жидкости при этом оказалось равным 6,4.
Неоднократно подчеркивалось, что если при фракционировании органическими растворителями температура слишком высока, то может произойти денатурация белка. Однако эта денатурация носит избирательный характер. Некоторые ферменты отличаются удивительной стабильностью. В частности, внеклеточные белки, а также ферменты термофильных организмов; должны быть более устойчивыми, что объясняется условиями их природного окружения. Такие белки выдерживают воздействие органических растворителей при повышенной температуре. Использование органических растворителей для избирательной денатурации обсуждается далее в разд. 3.6.
3.5. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ ПОЛИМЕРАМИ И ДРУГИМИ ВЕЩЕСТВАМИ
Белки агрегируют без денатурации не только под действием солей и органических растворителей. Полсон и др. [32] иссле^ довали способность различных высокомолекулярных нейтраль^ ных водорастворимых полимеров осаждать белки плазмы. Хотя некоторые из них эффективно осаждали белки, высокая вяз-кость растворов полимеров препятствует их практическому ис-пользованию. Единственным исключением является полиэтилен-гликоль различной степени полимеризации. Растворы этого полимера при концентрации до 20% (вес/объем) имеют не очень большую вязкость, и многие компоненты плазмы осаждаются полиэтиленгликолем до того, как его концентрация до* стигает 20% (вес/объем). Наиболее эффективным является по-лиэтиленгликоль с мол. массой 4000 и выше; для осаждения белков обычно используют полиэтиленгликоль двух типов — с мол. массами около 6000 и 20 000. Поведение белков в растворах полиэтиленгликоля довольно сходно с их поведением а процессе осаждения органическими растворителями. Действительно, молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ) можно рассматривать как полимерный органический растворитель, хотя для получения нужной степени осаждения требуются более низкие его концентрации. При добавлении ПЭГ первым из плазмы выпадает в осадок фибриноген — довольно крупный белок, имеющий сильно асимметричные молекулы и обладающий наименьшей «растворимостью» в плазме. Затем (при нейтральном pH,, близком к изоэлектрической точке) осаждаются у_глобулины, а вслед за ними и другие компоненты. Как и в органических растворителях, растворимость белков в растворах ПЭГ возрастает по мере удаления pH от их изоэлектрической точки.
ПЭГ довольно успешно применяется для осаждения белков,.
6—1078
82
Глава 3____________
например «глобулинов», которые по своей природе обладают низкой растворимостью. Чтобы осадить другие белки, относящиеся к «альбуминам», могут потребоваться такие высокие концентрации ПЭГ, что а) вязкость и плотность раствора будут препятствовать центрифугированию и б) в сложных по составу белковых экстрактах может произойти разделение фаз на богатую белками тяжелую и более легкую фазы.
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed