Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
78
Глава 3
рителя точка замерзания смеси снижается. Однако большинство ферментов относительно более стабильны, и, вероятно, нет необходимости поддерживать температуру ниже 10 °С, если концентрация растворителя составляет менее 20% (по объему). После добавления нужного количества растворителя дальнейшего разогревания не происходит, и поэтому можно легко поддерживать постоянную температуру. На рис. 3.13 показана типичная температурная кривая, полученная при постепенном добавлении к водному раствору холодного (и непрерывно охлаждаемого) органического растворителя.
После добавления первой порции растворителя (ацетона или этанола), обычно до 20—30%-ной концентрации, необходимо строго поддерживать соответствующую для данного случая температуру (например, 0°С) в течение 10—15 мин, прежде чем проводить центрифугирование в предварительно охлажденном роторе. Количество осадка в значительной степени зависит от температуры, увеличиваясь при более низкой температуре-(Редкое исключение из естественного «закона подлости», который гласит, что стоит что-либо одно изменить, как что-то другое тут же изменится к худшему. Снижение температуры не только уменьшает возможность денатурации, но и позволяет использовать более низкие концентрации органического растворителя.) Так как очень трудно точно поддерживать температуру ниже 0°С, особенно во время центрифугирования, на практике для осаждения белков органическими растворителями обычно используют температуру 0°С±1°С.
Большинство ферментов осаждаются при добавлении ацетона в концентрации от 20 до 50% (по объему). Определение процентного содержания по объему не такое уж простое дело. Строго говоря, к термину «процентное содержание» следует добавить слова: «Исходя из предположения об аддитивности объемов». Так, если к 50 мл ацетона добавить 50 мл воды, то общий объем жидкости составит только 95 мл. Считать, что в этом случае концентрация ацетона составляет «50% по объему в предположении об аддитивности объемов», конечно, неверно, но по крайней мере из этого определения ясно, как производится расчет. Аналогично при смешивании этанола с водой в соотношении 50:50 объем изменяется на 4%. Уменьшение объема происходит за счет образования гидратированных комплексов растворителя, которые занимают меньший объем, чем составляющие их компоненты. Такое изменение объема представляет собой наибольшую разницу между объемом, получаемым при достижении нужной концентрации в один этап (например, от 0 до 50%) путем добавления равного объема растворителя, и объемом, получаемым при достижении той же концентрации в несколько этапов. Однако вряд ли это имеет какое-то сущест-
Разделение белков путем осаждения
79
венное значение. Если в протоколе эксперимента нет точных указаний, то можно считать, что рассчитанная концентрация представляет собой «процент по объему в предположении, что объемы аддитивны».
После уравновешивания смеси при данной концентрации растворителя и определенной температуре в течение 10—15 мин осадок можно отделить центрифугированием. Плотность большинства органических растворителей, смешиваемых с водой, ниже плотности воды, поэтому седиментация агрегированного белка происходит очень быстро. При высокой концентрации растворителя и больших объемах смеси седиментация при 1 g (т. е. при стоянии) может быть достаточно быстрой, что позволяет декантировать большую часть надосадочной жидкости, не прибегая к центрифугированию. Однако обычно центрифугирование необходимо. Для этого вполне пригодны центрифуги большой емкости, создающие ускорение всего в несколько тысяч g, при условии что они имеют охлаждение. Не лишним будет еще раз подчеркнуть, что для получения воспроизводимых результатов необходимо поддерживать постоянную температуру как перед центрифугированием, так и во время него.
Далее осадок снова растворяют в холодном буфере подходящего состава. Если при диспергировании осадка не получается прозрачного раствора, не стоит добавлять избыток буфера — вероятно, в растворе есть денатурированный белок. Обычно легче диспергировать белковый осадок в небольшом объеме.
Использование объема буфера, превышающего объем осадка в два раза, позволяет вдвое снизить концентрацию органического растворителя; в результате должен получиться раствор, содержащий весь неденатурированный белок. Если же раствор сильно разведен, его трудно сконцентрировать вновь. Кроме того, если излишки органического растворителя удаляют выпариванием, то чем выше его исходная концентрация, тем быстрее он испаряется.
Небольшие количества органического растворителя (например, до 10% по объему) практически не оказывают влияния на результаты фракционирования другими методами. Исключение составляют методы гидрофобной хроматографии (разд. 4.8) и аффинной адсорбции, зависящие от гидрофобных взаимодействий (разд. 4.5), а также часто фракционирование с помощью высаливания. Если фермент относительно стабилен к действию растворителя, фракционирование сульфатом аммония можно проводить в присутствии растворителя. Однако концентрация соли, необходимая для осаждения белка, будет при этом, вероятно, несколько выше, что обусловлено присутствием молекул органического растворителя, препятствующих гидрофобной агрегации белка при высокой концентрации соли. Излишки рас*
