Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 29

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 23 24 25 26 27 28 < 29 > 30 31 32 33 34 35 .. 145 >> Следующая

+
Разделение белков путем осаждения
75
взаимодействия
Молекулы органического растворителя (^/ч) взаимодействуют с гидрофобными остатками
Рис. 3.12. Денатурирующее действие органических растворителей на белки.
взаимосвязь размера белковых молекул и значения изоэлектри-ческой точки со способностью белков к осаждению [29]. В ранних исследованиях по фракционированию органическими растворителями было установлено, что для экстрактов из мышц кролика наиболее подходящим растворителем является ацетон при pH 6,5 [31]. Изоэлектрические точки основных компонентов, содержащихся в экстрактах мышц млекопитающих, лежат в области pH 6,0—7,5 (при использовании для экстракции фосфатного буфера).
Выбор растворителя
Используемый растворитель должен полностью смешиваться с водой, не реагировать с белками и обладать хорошим осаждающим действием. Два наиболее широко используемых рас-
76
Глава 3
творителя — это этанол и ацетон. Применяются также метанол, н-пропанол, изопропанол, диоксан, 2-метоксиэтанол (метилцел-лосольв) и другие, более редкие спирты, эфиры и кетоны. Важным условием их применения является безопасность как в смысле воспламеняемости растворителя, так и токсичности его паров. По этим причинам диоксан, 2-метоксиэтанол и другие эфиры следует исключить из приведенного списка.
Одно из преимуществ фракционирования с помощью органических растворителей заключается в том, что его можно проводить при /температуре ниже нуля, так как все смешивающиеся с водой растворители образуют смеси, замерзающие при температуре значительно ниже 0°С. Это очень важное свойство, так как в ходе фракционирования необходимо поддерживать низкую температуру. При температуре выше +Ю°С становится заметным денатурирующее действие органического растворителя. Денатурация связана с изменением молекулярных гидрофобных взаимодействий, стабилизирующих структуру белка. Отсутствие денатурации при низкой температуре обусловлено малой вероятностью того, что молекулы органического растворителя проникают во внутренние участки белковой глобулы и дестабилизируют ее. При более высоких температурах небольшие молекулы органических веществ проникают в поверхностные «трещины», образующиеся спонтанно в результате естественной подвижности структуры, и связываются за счет гидрофобных взаимодействий с внутриглобулярными остатками, такими, как Leu, lie, Туг, Phe, Val и т.д. (рис. 3.12). С повышением температуры внутренние гидрофобные взаимодействия в белковой молекуле усиливаются и начинают играть относительно более важную роль в поддержании целостности молекулы. Все это ведет к автокаталитической денатурации.
Некоторые органические растворители проявляют более сильное денатурирующее действие, чем другие. Давно установлено, что спирты с длинной цепью обладают более высокой денатурирующей способностью по сравнению с короткоцепочечными спиртами. Примеры этого приведены в разд. 3.5. Хотя этанол и используется в стандартных методах фракционирования белков плазмы [30], необходимо отметить, что эти белки (лишь немногие из них относятся к ферментам) составляют группу, характеризующуюся необычной стабильностью и переносящую условия, в которых денатурируют более чувствительные белки. Ацетон обладает менее денатурирующим действием, чем этанол, отчасти потому, что при низкой температуре требуются несколько более низкие его концентрации, чтобы получить такое же осаждение, как и при использовании этанола. Он также более летуч, что позволяет легко удалять его из растворенного осадка при пониженном давлении.
Разделение белков путем осаждения
77
Методика проведения фракционирования
Образец, подвергаемый фракционированию, необходимо охладить до 0°С. Чтобы достичь такой низкой температуры, нужно приготовить ледяную баню с солью или другую емкость, в которой можно поддерживать температуру ниже 0°С. Концентрация белка может быть 5—30 мг*мл-1, а концентрация соли не должна быть слишком высокой. При высокой концентрации соли (например, после фракционирования сульфатом аммония) электростатическая агрегация снижается и требуются более высокие концентрации органического растворителя, что увеличивает вероятность денатурации, С другой стороны, при очень низкой концентрации соли может образоваться весьма тонкая взвесь, которую трудно осадить. В идеале исходная величина ионной силы должна быть 0,05—0,2. При добавлении растворителя к воде происходит выделение тепла, как как величина АН° гидратации молекул растворителя имеет отрицательное значение. Поэтому добавление растворителя нужно производить медленно при эффективном охлаждении (для обеспечения хорошей теплопроводности используйте стеклянный, а не пластиковый контейнер; лучше даже использовать посуду из нержавеющей стали). Если фермент особенно неустойчив к действию органических растворителей, то, может быть, лучше, чтобы температура была ниже 0°С, так как при добавлении раство-
Концентрация добавленного растворителя при 0°С, % по объему
Рис. 3.13. Изменения температуры водного раствора по мере добавления к нему холодного органического растворителя при эффективном охлаждении. При достижении 10%-ной концентрации органического растворителя разогревание раствора за счет гидратации растворителя ослабевает по сравнению с внешним охлаждением. Когда концентрация органического растворителя достигает 20%, разогревание становится незначительным или совсем прекращается.
Предыдущая << 1 .. 23 24 25 26 27 28 < 29 > 30 31 32 33 34 35 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed