Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Общая теория
Органический растворитель
Гидрофобный участок
Рис. 3.9. Агрегация белков вследствие их взаимодействия в смеси воды с органическим растворителем.
Разделение белков путем осаждения
73
применения. В сущности, он используется слишком редко, если учесть, что у него есть некоторые преимущества по сравнению с осаждением белков путем высаливания, хотя ему присущ и ряд недостатков. Поскольку этот метод основан на других принципах осаждения, он может быть использован не вместо сульфата аммония, а как дополнительная стадия очистки.
Добавление к водному экстракту, содержащему белки, таких растворителей, как этанол или ацетон, вызывает различные эффекты, которые вместе приводят к осаждению белка. Основной эффект заключается в снижении активности воды. По мере возрастания концентрации органических растворителей снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Это можно объяснить снижением диэлектрической постоянной растворителя или же просто вытеснением большой массы воды и частичной иммобилизацией ее молекул вследствие гидратации молекул органического растворителя. Молекулы воды, расположенные упорядоченным образом вокруг гидрофобных участков на поверхности белка, могут быть замещены молекулами органического растворителя, что приводит к относительно более высокой «растворимости» этих участков. Некоторые сильно гидрофобные белки (обычно мембранные) могут растворяться в 100%-ном органическом растворителе. Однако суммарное действие органических растворителей на цитоплазматические и другие водорастворимые белки состоит в снижении их растворимости до уровня, при котором начинаются агрегация и осаждение.
6,0
? 5,0
с.
о
5
s
-е-
Фосфорилаза
МВ Пируваткиназа шт Альдолаза
Лактатдегидрогеназа Енолаза
К реатинкиназа #
Фосфоглицерат киназа
шнв Миокиназа наш Миоглобин
шяш Парвальбумин
____I____I_____1_____I----(JL
20 40 60 80
Концентрация ацетр^а, % по объему
Рис. ЗЛО. Приблизительные области осаждения некоторых белков из экстрактов мышц различными концентрациями ацетона при 0°С, pH 6,5, 1—0,1 [29].
74
Глава 3
1 2 3 4 5
Старт Рис* Электрофореграмма ацетоновых
фракций из экстракта мышц карпа, полученная на крахмальном геле при pH 6,5. Видно разделение парвальбуминов II, III и IV (мол. jy масса приблизительно равна 11 000). 1—цель-
ный экстракт; 2, 3, 4 и 5 — фракции, полу-щ ченные при концентрации (в % по объему)
ацетона соответственно 55—60, 60—65, 65—70 Я и 70—80. Последней осаждается наиболее
кислая зона, так как она больше других удалена от изоэлектрической точки (приблизительно 4,0) [29].
Основная причина агрегации белков заключается, вероятно, в электростатических и вандерваальсовых силах, сходных с силами, действующими при высаливании белков в отсутствие органического растворителя. Гидрофобные взаимодействия имеют здесь меньшее значение из-за солюбилизирующего влияния органических растворителей на неполярные участки белковой глобулы. Было установлено, что вблизи изоэлектрической точки белков осаждение происходит при более низкой концентрации органического растворителя. Это подтверждает предположение о том, что агрегация, происходящая в данном случае, сходна с агрегацией, наблюдающейся при изоэлектрическом осаждении белков. На рис. 3.9 схематически изображены молекулы белков в смеси воды с органическим растворителем; агрегация здесь происходит за счет взаимодействий между противоположно заряженными участками на поверхности белков.
Другим параметром, влияющим на осаждение белка под действием органического растворителя, является размер молекулы. При прочих равных условиях чем больше молекула, тем ниже концентрация органического растворителя, вызывающая осаждение белка. Так, если бы можно было сравнивать способность к осаждению белков, различающихся по величине молекул, но сходных по гидрофобности и изоэлектричес-ким точкам, то оказалось бы, что эта способность связана с размером молекул обратной зависимостью. На практике же присутствующие в данной смеси белки, различающиеся по составу и общему заряду, тем не менее хорошо подчиняются этому приблизительному правилу. Крупные молекулы агрегируют быстрее, чем мелкие, так как для них больше вероятность того, что на их поверхности находится заряженный участок, комплементарный другому белку (рис. 3.9). На рис. 3.10 и 3.11 представлены некоторые экспериментальные данные, показывающие
