Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Перед добавлением твердого сульфата аммония его взвешивают, разбивают все комки и медленно добавляют соль к раствору при перемешивании. Первую порцию можно растворить достаточно быстро, но по мере приближения к заданному проценту насыщения последние порции соли необходимо добавлять более медленно. Растворенный воздух может выходить из раствора и вызывать вспенивание, но это не оказывает какого-либо вредного воздействия на белки; однако если вспенивание происходит в результате слишком энергичного перемешивания, то поверхностное натяжение, действующее на белки, попавшие в пузырьки, может привести к их денатурации. После растворения последней порции соли перемешивание необходимо продолжать в течение 10—30 мин до достижения полного равновесия между растворенными и агрегированными белками; затем раствор центрифугируют. Обычно достаточно центрифугировать при 105?./мин (например, при 10 ООО g в течение 10 мин или при 3000g в течение 30 мин). При высоких концентрациях соли может понадобиться более длительное центрифугирование. Над-осадочную жидкость сливают, измеряют ее объем и подсчитывают количество соли, необходимое для следующего фракционирования. Осадок растворяют в нужном буфере. Следует отметить, что объем буфера не должен превышать объем осадка более чем в 1—2 раза, так как этого достаточно, чтобы концентрация соли оказалась значительно ниже точки преципитации белков, присутствующих в растворе. Если весь осадок не
Разделение белков путем осаждения
71
растворяется, то нерастворимый материал, вероятно, представляет собой денатурированные частицы и его нужно удалить центрифугированием. Белковые растворы лучше всего хранить в наиболее концентрированном виде. Это повышает стабильность белков, и, кроме того, всегда легче потом разбавить раствор, чем сконцентрировать его.
Вновь растворенный осадок содержит значительные количества сульфата аммония, который необходимо удалить перед следующей стадией очистки. Для этого обычно используют такие методы, как диализ или гель-фильтрация на «обессоливающей» колонке (разд. 1.4). Активность фермента можно определить в растворенном осадке или надосадочной жидкости, но в последнем случае нужно быть уверенным, что количество сульфата аммония, добавленное в определяемую смесь вместе с образцом, не скажется на результатах.
Определение активности в осадке нужно проводить в любом случае. Хотя потери при фракционировании сульфатом аммония обычно невелики, активность, содержащаяся в осадке, может быть меньше, чем разность между активностями в двух последовательно полученных надосадочных жидкостях.
Вместо растворения твердой соли в образце в него можно добавлять нужное количество насыщенного раствора так же, как это делается при добавлении органических растворителей (разд. 3.4). Такой прием особенно полезен, если фермент полностью осаждается при 50%-ном насыщении, так как при этом объем возрастает только в два раза. При работе в больших масштабах добавление сульфата аммония в виде раствора неприемлемо, но для выделения белков в малых количествах это вполне подходящий метод. При более высоком проценте насыщения объем раствора увеличивается еще больше, а происходящее при этом разбавление белка в свою очередь требует еще более высокой степени насыщения, чтобы осаждение было столь же эффективным. Поэтому данный метод не рекомендуется использовать при степени насыщения выше 50%.
Очень важно помнить, что соль никогда не осаждает фермент полностью, а только снижает его растворимость. Если исходная смесь содержит, скажем, 1 мг-мл-1 нужного фермента, то снижение растворимости до 0,1 мг*мл-1 означает 90%-ное осаждение фермента. Это достаточно высокий выход. С другой стороны, если исходная концентрация фермента составляет только 0,1 мг-мл-1, то при той же концентрации соли осаждения фермента не произойдет. Другими словами, область концентрации соли, осаждающей фермент, зависит не только от свойств самого фермента, но и от свойств других белков, присутствующих в растворе (соосаждение), а также от концентрации белка в исходном растворе.
72
Глава 3
Наконец, очень важно применение высаливания не столько для фракционирования образцов, сколько для их концентрирования. Может возникнуть необходимость в концентрировании элюата, полученного с ионообменной колонки или после гель-фильтрации. Высаливание при добавлении необходимого количества сульфата аммония для осаждения всех белков является эффективным способом концентрирования — при условии, что образец, который нужно сконцентрировать, не слишком разбавлен. Для получения раствора приблизительно 85%-ного насыщения удобно растворить 60 г сульфата аммония в 100 мл. При такой концентрации сульфата аммония немногие белки имеют растворимость выше 0,1 мг-мл-1. Но если исходная концентрация белка в растворе ниже 1 мг-мл”1, то перед высаливанием следует попытаться повысить ее, например с помощью ультрафильтрации (разд. 1.4).
3.4, ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ
Метод осаждения белков смешивающимися с водой органическими растворителями применяется с тех самых пор, как начали заниматься очисткой белков. Особенно важную роль он играет при выделении белков в промышленных масштабах, в частности при фракционировании белков плазмы [30]. Однако в лабораторных условиях этот метод не нашел столь широкого
