Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Количество (г) = '• <3'5а>
5*
68
Глава 3
Количество сульфата аммония в граммах, которое нужно добавить к 1 л раствора при 20 °С, чтобы из раствора с насыщением Si % получить раствор с насыщением S2 %, равно
КоличестЕО (г) = (3.56)
Обе эти формулы основаны на допущении, что раствор 100%-ного насыщения соответствует 4,05 М раствору. Следует отметить, чхо~ на практике из-за присутствия в растворе других солей и белка истинная растворимость сульфата аммония в образце будет несколько меньше, чем 533 г-л-1 при 20°С. Количество необходимого сульфата аммония можно найти в приложении А в таблице I, где оно дано с интервалом в 5%. Значения для других степеней насыщения можно получить исходя из этих цифр путем интерполяции. Значение pH может быть важным при осаждении, однако в большинстве случаев при незначительном изменении pH от эксперимента к эксперименту разница оказывается несущественной. Лучше всего работать при нейтральных значениях pH (6—7,5). Сульфат аммония обладает слабым подкисляющим действием, поэтому раствор должен содержать буфер (например, фосфатный) примерно 50 мМ концентрации.
Одной из наиболее хорошо изученных систем, фракционируемых с помощью сульфата аммония, является экстракт мышц кролика. Чок и Бюхер [27] разделили экстракт на пять фракций путем осаждения сульфатом аммония; каждая фракция была обогащена определенными ферментами. Взяв за основу эту работу, можно выделить все гликолитические ферменты, а так-
Рис. 3.8. Осаждение белков из грубого экстракта ткани при различной степени насыщения сульфатом аммония.
Разделение белков путем осаждения
69
же и некоторые другие, разделив экстракт осаждением сульфатом аммония на четыре фракции [28].
Фракционирование сульфатом аммония имеет одно важное преимущество по сравнению практически со всеми другими методами — оно приводит к стабилизации белков. Суспензия белкового осадка или кристаллов в 2—3 М растворе сульфата аммония стабильна в течение многих лет. Это обычный метод хранения коммерческих ферментов. Высокая концентрация соли предотвращает также протеолиз и действие бактерий (разд. 6.2). В процессе очистки всегда бывает полезно иметь стадию, на которой образец можно оставить на ночь. Такой стадией может быть получение осадка в растворе сульфата аммония, как от-центрифугированного, так и неотцентрифугированного, хотя в некоторых случаях образец лучше хранить замороженным.
После того как решено использовать фракционирование с помощью сульфата аммония, необходимо определить, каким должен быть процент насыщения. При насыщении менее 25% обычно осаждаются частицы, а также агрегированные или очень
Таблица 3.2. Пробное фракционирование сульфатом аммония [29]
Степень насыще- Количество Количество Степень
ния, % осажденного осажденного очистки1)
фермента, % белка, %
Первый опыт 0---40 4 25
40---60 62 22 2,8
60---80 32 32 1,0
80 (надосадочная 2 21
жидкость)
Вывод: При насыщении 40---60% осаждается больше фермента, чем при на
сыщении 60---80%; проверить область 45---70%.
Второй опыт 0---45 6 32
45-70 90 38 2,4
70 (надосадочная 4 30
ЖИДКОСТЬ)'
Вывод: выход хороший, но степень очистки ниже, чем в первом опыте; если
чистота препарата имеет первостепенное значение, то следует испробовать
---------------- ------- Л о сс п/
концентрации в пределах 48—65%.
Третий опыт 0---48 10 35
48-65 75 25 3,0
65 (надосадочная 15 40
жидкость)
') Отношение удельной активности фракции к удельной активности исходного образца.
70
Глава 3
высокомолекулярные белки. На рис. 3.8 показана типичная картина распределения белка при его осаждении из грубого экстракта. В таблице 3.2 даны идеализированные результаты пробного фракционирования сульфатом аммония. Процесс фракционирования — это всегда компромисс между выходом активности и степенью очистки. Если стоимость исходного материала высока, или его трудно получить, или если поставлена цель — выделить как можно больше фермента, не заботясь о том, чтоб„ы он был абсолютно чистым, тогда можно пожертвовать степенью очистки ради выхода. С другой стороны, если фракционирование является первой стадией работы с легко доступным материалом, то ради получения чистого фермента можно пожертвовать полнотой его выделения. Во многих случаях после фракционирования сульфатом аммония используют более сложные методы [например, ионообменную хроматографию (разд. 4.3) или аффинную адсорбционную хроматографию (разд. 4.5)]. При этом поведение нужного фермента может не зависеть от количества примесей. В таком случае часто используют грубое фракционирование сульфатом аммония, которое дает незначительную очистку, но служит этапом, необходимым для подготовки экстракта к адсорбционной хроматографии.
