Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
52 111 176 250 333 428 538 666 818
5 55 117 187 266 357 461 583 727
10 58 125 200 285 384 500 636
15 62 133 214 307 416 545
20 66 142 230 333 454
25 71 153 250 363
30 76 166 272
35 с 83 181
40 90
45
50
От 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
«1 %
0 1000 1222 1500 1857 2333 3000 4000 5666 9000 19 000
5 900 1111 1375 1714 2166 2800 3750 5333 8500 18 000
(0 800 1000 1250 1571 2000 2600 3500 5000 8000 17 000
15 700 888 1125 1428 1833 2400 3250 4666 7500 16 000
20 600 777 1000 1285 1666 2200 3000 4333 7000 15 000
25 500 666 875 1142 1500 2000 2750 4000 6500 14 000
30 400 555 750 1000 1333 1800 2500 3666 6000 13 000
¦35 300 444 625 857 1166 1600 2250 3333 5500 12 000
40 200 333 500 714 1000 1400 2000 3000 5000 11 000
<45 100 222 375 571 833 1200 1750 2666 4500 10 000
50 111 250 428 666 1000 1500 2333 4000 9 000
55 125 285 500 800 1250 2000 3500 8 000
60 142 333 600 1000 1666 3000 7 000
65 166 400 750 1333 2500 6 000
70 200 500 1000 2000 5 000
75 250 666 1500 4 000
80 333 1000 3 000
85 500 2 000
90 1 000
ПРИЛОЖЕНИЕ Б
РАСТВОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА
1. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ [202]
Растворяют 1,5 г сульфата меди (CuSCVSPhO) и 6,0 г тартрата калия и натрия в 500 мл воды. Добавляют 300 мл 10%-ной гидроокиси натрия и доводят объем водой до 1 л. Если к этому раствору добавить еще 1 г иодида калия, то реактив будет храниться в пластиковом сосуде в течение неопределенно долгого времени.
Определение белка
К 0,5 мл раствора белка неизвестной концентрации (до 3 мг) добавляют 2,5 мл реактива. Перед измерением оптической плотности при 540 нм раствор выдерживают 20—30 мин.
2. РЕАКЦИЯ ЛОУРИ [171]
Реактив А. Растворяют 0,5 г сульфата меди (CuS04*5H20) и
1 г цитрата натрия (Ыа3-цитрат) в 100 мл воды. Зтот раствор хранится неопределенно долгое время и более устойчив, чем обычная медьтартратная смесь [202].
Реактив В. 20 г карбоната натрия (Na2C03) и 4 г гидроокиси натрия растворяют в 1 л воды.
Реактив С. К 50 мл реактива В добавляют 1 мл реактива А. Реактив D. К 10 мл реактива Фолина—Чиокалто добавляют 10 мл воды.
Определение белка
К 0,5 мл неизвестного раствора, содержащего не более 0,5 мг белка, добавляют 2,5 мл реактива С, перемешивают и оставляют на 5—10 мин. Затем добавляют 0,25 мл реактива D. Раствор тщательно перемешивают и оставляют на 20—30 мин, развившуюся окраску измеряют при подходящей длине волны между €00 и 750 нм. Следует заметить, что из-за различий в силе реактива Фолина—Чиокалто развитие окраски может быть неудов-
342
Приложение Б
летворительным. Степень разбавления этого реактива (или количество добавляемого реактива) можно изменять таким образом, чтобы после добавления реактивов С и iD pH конечной смеси находился между 10,0 и 10,5. При более высоких значениях pH окраска развивается быстрее, но и быстрее исчезает.
В автоматизированных системах, в которых время реакции точно контролируется, более предпочтительно быстрое развитие окраски при pH 11,0; для этого необходимо повысить концентрацию NaOH в реактиве В до 30—40%.
3. СВЯЗЫВАНИЕ БЕЛКА С КУМАССИ СИНИМ
*
а) 100 мг кумасси ярко-синего G-250 растворяют при энергичном перемешивании в 50 мл 95%-ного этанола и смешивают этот раствор со 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты. Смесь разбавляют до 1 л водой и фильтруют для удаления нерас-творившегося красителя. Раствор устойчив 1—2 нед.
б) 60 мг кумасси ярко-синего G-250 растворяют в 1 л 3%-ной надхлорной кислоты и фильтруют для удаления нераство-рившегося красителя. Величина поглощения при 465 нм должна быть между 1,3 и 1,5. Этот раствор устойчив в течение неопределенно долгого времени.
Определение белка
К 1,5 мл образца, содержащего не более 50 мкг белка, добавляют 1,5 мл реактива; через 20—30 мин измеряют поглощение при 595 нм. Если имеют дело с концентрированными белковыми растворами (>5 мг/мл), удобнее взять 1,5 мл воды или разбавленного раствора хлористого натрия, добавить образец при помощи микролитрового шприца, тщательно перемешать раствор и затем добавить в него красящий реактив. Концентрированный белковый раствор при контакте с красящим реактивом будет давать осадок. Реактив а) дает более высокое поглощение, чем реактив б), но он менее устойчив.
