Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
334
Глава 9
центрации сульфата аммония до 52% насыщения альдолаза начинала медленно кристаллизоваться. Присутствие 85% других белков не мешало этой кристаллизации. Отсюда следует, что образование кристаллов фермента не может служить доказательством того, что раствор, из которого они выпадают, содержит чистый фермент. Однако мало вероятно, что в самих кристаллах содержится много примесей, если только не происходит одновременно кристаллизации или аморфной агрегации примеси в момент кристаллизации интересующего нас фермента. В последнем случае существенно то, что кристаллы фермента, даже если они и не загрязнены посторонними примесями, невозможно собрать отдельно от других выпавших в осадок белков.
Хотя кристаллизация как этап очистки может быть весьма полезной, выход фермента по активности будет недостаточно высоким, если кристаллизация не доведена до конца. При быстром образовании микрокристаллов результаты получаются не хуже, чем при медленном выращивании крупных кристаллов; быстрое проведение кристаллизации и перекристаллизации оказалось в ряде случаев весьма эффективным [35, 195]. При осуществлении последовательных этапов перекристаллизации необходимо достигнуть стационарного состояния, когда удельная активность перестает возрастать. Это также один из критериев гомогенности.
Еще одно важное достоинство кристаллизации это то, что она позволяет сохранять в течение длительного времени очищенные белки. Многие фирмы выпускают ферментные препараты в виде суспензии кристаллов не просто из желания продемонстрировать высокую степень их чистоты, а потому что такие суспензии — это самый надежный метод хранения ферментов (кроме, может быть, глубокого замораживания). Это объясняется рядом причин. Во-первых, молекулы в кристаллах плотно упакованы и потому оказываются иммобилизованными, так что вероятность тепловой денатурации снижается. Далее, трудно себе представить, что протеолитические ферменты, присутствующие в препарате, могут кристаллизоваться вместе с очищенным ферментом или белком (хотя протеазы могут вполне адсорбироваться на поверхности кристаллов). Поэтому в суспензии кристаллов большинство белковых молекул предохранено от протеолитической деградации. И наконец, кристаллизация обычно проводится в условиях высоких концентраций сульфата аммония, что предотвращает бактериальное загрязнение и стабилизирует белковые молекулы.
Определение чистоты белков; кристаллизация
335
Методы кристаллизации
Чтобы началась кристаллизация белков, необходимо создать такие условия, в которых белковый раствор становится перенасыщенным, что приводит к белок-белковой агрегации. Для выращивания крупных кристаллов лучше всего использовать не слишком перенасыщенные растворы, в которых нет аморфных осадков. Однако при удалении белка из раствора по мере образования кристаллов раствор перестает быть перенасыщенным и рост кристаллов прекращается. Кристаллизация, используемая как метод очистки, приводит к большим потерям белка, который остается в надосадочной жидкости. Однако путем непрерывной регуляции соответствующих условий белковый раствор можно поддерживать в перенасыщенном состоянии до тех пор, пока почти весь белок не закристаллизуется. Чтобы достичь перенасыщенного состояния, можно использовать любой осадитель из перечисленных в гл. 3. Хотя чаще всего для этой цели применяют сульфат аммония, кристаллы, образующиеся в условиях «всаливания» (при низкой ионной силе), могут быть пригодны для рентгеноструктурного анализа; однако при этом необходимо побеспокоиться о поддержании белка в стабильном состоянии из-за возможного загрязнения препарата микроорганизмами. Иногда с успехом применяются органические растворители, но из-за длительности этой процедуры необходимо поддерживать низкие температуры.
В ряде случаев, когда сульфат аммония не способствовал росту крупных кристаллов, он был удачно заменен полиэтилен-гликолем [196, 197]. Опубликовано несколько теоретических и практических работ по проблемам выращивания крупных кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа биополимеров [198—201].
Обычно требуется тщательное изучение условий кристаллизации конкретного белка, так как небольшие изменения pH, концентрации буфера или ионов металлов могут существенно ухудшать качество образующихся кристаллов. Один и тот же фермент, выделяемый из разных видов, может вести себя совершенно по-разному. Кристаллографы чаще всего используют ферменты из необычных источников именно потому, что фермент из какого-то одного вида кристаллизуется легче, чем фер*-менты из многих других видов. Отсюда: кашалот, омар, лошадь, кошка, курица и пр., а не крыса, кролик или Е. coli.
Чтобы осуществить кристаллизацию с целью стабилизировать фермент для длительного его хранения, не требуется столь строго контролируемых условий. Для хранения пригодны микроскопически мелкие кристаллы. В самом деле, работать с
"крупными кристаллами даже неудобно, когда из запаса фермента нужно взять какое-то определенное его количество. Наиболее пригодный способ кристаллизации ферментов, предназначенных для хранения, заключается в том, что к ферментному раствору добавляют сульфат аммония. При высокой концентрации соли фермент сначала полностью переходит из раствора в осадок, т. е. «высаливается». Суспензию снова растворяют в маленьком объеме соответствующего буфера, после чего добавляют по каплям насыщенный раствор сульфата аммония до тех пор, пока в растворе не будет обнаруживаться небольшая устойчивая мутность. Затем образец быстро центрифугируют, чтобы удалить любые следы пыли, волоски, денатурированный белок, и надосадочную жидкость помещают на холод. Если приблизительно через день кристаллы не образуются, а раствор становится более мутным, добавляют еще небольшое количество сульфата аммония.
