Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
22*
332
Глава 9
9.3. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
Вполне уместно завершить эту книгу разделом о кристаллизации ферментов, поскольку получение кристаллов часто представляет собой конечную стадию очистки и изучения фермента. Часть этого раздела следовало бы поместить в гл. Зг потому что кристаллизация как метод осаждения—это очень, хороший и часто используемый способ очистки ферментов. Но все же более уместно обсудить его в общих чертах в этом разделе. Кристаллизация играет важную роль в научных исследованиях по меньшей мере четырех типов; она используется: 1) как метод очистки ферментов, 2) для подтверждения гомогенности ферментных препаратов, 3) как метод стабилизации ферментов при хранении и 4) для определения третичной структуры ферментов методом рентгеноструктурного анализа.
Способ получения кристаллов одинаков для всех областей использования кристаллизации (за исключением, может быть, п. 4 — см. далее), поэтому все они могут быть обсуждены вместе. Кристаллы образуются из пересыщенных растворов вследствие агрегации молекул высокоупорядоченным образом, а не в результате беспорядочной агрегации, которая приводит к образованию аморфных осадков. Кристаллы в большинстве случаев представляют собой термодинамически более предпочтительное состояние, чем аморфные осадки (в противном случае они не могли бы образоваться); тем не менее при поверхностном взгляде это кажется неожиданным, так как кристаллизация явно сопровождается возрастанием упорядоченности в пространственном расположении белковых молекул, а следовательно, и уменьшением энтропии белка. Однако термодинамика целой системы гораздо сложнее. Разупорядочение ранее связанных молекул растворителя во много раз превышает фактор упорядочения молекул белка. Простые органические вещества могут кристаллизоваться из подходящих растворителей, и кристаллы за несколько секунд вырастают в размерах до нескольких миллиметров. Но кристаллы белков растут не так быстро, потому что диффузия, столкновения и повороты больших молекул происходят гораздо медленнее. Чтобы взаимодействовать друг с другом соответствующим образом и образовывать правильные кристаллы, молекулы должны сталкиваться только под определенным углом. Но, прежде чем произойдет правильное соударение молекул, может быть много «непродуктивных» столкновений. Поэтому белковые кристаллы приходится выращивать длительное время, особенно если необходимо получить более крупные кристаллы. Но иногда микрокристаллы образуются очень быстро. Об этом можно судить по появлению характерного двойного лучепреломления при встряхивании суспензии асим-
Определение чистоты белков; кристаллизация
т
метричных частиц, размеры которых лишь немного превышают длину волны видимого света. Микрокристаллы имеют обычно удлиненную, иглоподобную форму; при перемешивании суспензии микрокристаллов наблюдаются очень красивые переливы.
Два кристаллографических признака, которые часто (но не всегда) связаны между собой, — это морфология самого кристалла и геометрическая природа молекулярной упаковки внутри кристалла. Последняя характеристика называется пространственной группой, которую не обязательно знать неспециалистам. Морфология, или форма, кристаллов — это то, что можно наблюдать непосредственно (при помощи микроскопа), и нередко для того или иного фермента характерна определенная форма кристаллов. Встречаются иглы с треугольным, квадратным или гексагональным сечением, ромбовидные или квадратные пластинки, глыбовидные кубы и усеченные октаэдры, гексагональные и другие бипирамиды. Некоторые ферменты в зависимости от условий выращивания образуют кристаллы различной формы. Обычно более крупные кристаллы должны выращиваться в таких условиях, которые не способствуют их быстрому росту; сосуды, в которые помещены кристаллы, должны быть очень чистыми, так как это в значительной мере исключает вероятность образования множественных центров кристаллизации; предпочтительно, чтобы кристаллы выращивались в помещении, где отсутствует вибрация. Такие кристаллы нужны для рентгеноструктурного анализа, и их выращивание занимает недели и месяцы. Для других приложений быстрота роста кристаллов важнее их абсолютных размеров.
При очистке ферментов кристаллизация часто является конечным этапом; иногда это не приводит к какому-либо повышению удельной активности, так как препарат, возможно, уже достаточно «чист». Когда в таблице, отражающей ход очистки фермента, в качестве последнего этапа представлена кристаллизация, это указывает на то, что фермент получен в достаточно чистом состоянии; кроме того, это означает, что такой кристаллический препарат пригоден для хранения. Но кристаллы могут образовываться в очень разнородных смесях белков. Если нежелательные примеси не находятся в перенасыщенном состоянии, то агрегация будет затрагивать молекулы только того белка, который присутствует в перенасыщенном состоянии. А если она будет протекать достаточно медленно, то могут образоваться кристаллы этого белка. Например, первоначальный метод очистки кроличьей альдолазы s[ 194] заключался в том, что к мышечному экстракту добавляли сульфат аммония до 50%-ного насыщения, а затем образовавшийся осадок удаляли. Можно подсчитать, что альдолаза составляла 15% белка, оставшегося в надосадочной жидкости. При увеличении кон-
