Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 9.7. Сканирование окрашенного геля для количественной характеристики белковых зон. Можно также сканировать неокрашенный гель при 280 нм, что позволяет определять белки - по их поглощению при этой длине волны.
IIIIIII1III пи
Окрашенная полоса цилиндрического геля
"Профиль оптической плотности после сканирования той же полосы
22—1078
330
Глава 9
методов (для исследования не только белков, но и нуклеиновых кислот). Характеристика очищенного белка одним из описанных здесь методов, по существу, является обязательной. Выпускаемые теперь усовершенствованные приборы для проведения электрофореза в тонком слое полиакриламидного геля позволяют даже малоопытному исследователю легко и быстро получать высокое разрешение. Безусловно, кроме тех методов, которые были описаны в данном разделе, существуют также принципиально другие методы, пригодные для тех же целей; анализ ферментных препаратов на основе двух различных принципов дает гораздо больше информации о предполагаемой чистоте и других характеристиках этих препаратов.
9.2. ДРУГИЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Эти методы по сравнению с универсальными и играющими очень важную роль в биохимической практике методами аналитического гель-электрофореза имеют ограниченное применение, поэтому их описание будет кратким. Цель анализа конечного продукта, полученного в результате очистки, заключается в том, чтобы выяснить, содержит ли он один или большее число белков, и обнаружить в нем примеси, даже если они присутствуют в очень малых количествах. Гель-электрофорез позволяет выявить примесь какого-то одного компонента, составляющую 1% содержания основного компонента при условии их хорошего разделения. Однако бывают случаи, когда электрофорез не пригоден для исследования препарата. Это особенно относится к липопротеинам и другим связанным с мембранами белкам, которые при электрофорезе ведут себя необычно и нуждаются в определенных детергентах для поддержания их структурной целостности. В этих случаях, может быть, лучше использовать ультрацентрифугирование как основной или по крайней мере дополнительный метод, позволяющий получить информацию о гетерогенности данного препарата. В опытах по скоростной седиментации хорошо разделяются компоненты с сильно различающимися коэффициентами седиментации, однако если примесь по этому параметру сходна с основным компонентом и особенно если ее относительное количество слишком мало, то этот метод не дает надежных сведений о гетерогенности препарата. Метод седиментационного равновесия более пригоден для детектирования небольших количеств примеси по отклонению экспериментальных данных от теоретической прямой зависимости между логарифмом концентрации и квадратом расстояния от седиментирующей частицы до оси вращения. Однако это от-
Определение чистоты белков; кристаллизация
331
клонение можно интерпретировать и иным образом, например как свидетельство димеризации основного компонента.
По данным N-концевого анализа белков можно в какой-то степени судить о гомогенности препарата. При условии что N-концевая аминокислота не ацетилирована или не заблокирована каким-либо иным способом, идентификация N-концевой аминокислоты только одного типа без малейших следов других аминокислот служит хорошим указанием на присутствие в препарате одного-единственного белка. Однако такой вывод должен быть подкреплен данными о том, что в препарате нет примесных белков с блокированными N-концами или с N-концевой аминокислотой, идентичной N-концевой аминокислоте основного компонента.
Аминокислотный состав также может дать сведения о предполагаемой гетерогенности препарата, при условии, что точно определены количества двух или более аминокислот и известна молекулярная масса субъединиц фермента. Если молярное содержание этих аминокислот нельзя выразить простым отношением, связанным с размером данного полипептида, то, вероятно, это объясняется присутствием большого количества примеси. Например, если известно, что молекулярная масса полипептида близка к 30000 дальтон, а количества триптофана и тирозина, определенные спектрофотометрически [193], равны соответственно 5,1 и 6,5 остатка на 30 000, то либо эти определения недостаточно корректны, либо в препарате присутствует примесь, отличающаяся от основного компонента соотношением триптофана и тирозина. По очевидным причинам такие аргументы могут быть убедительными только в случае небольших по размерам полипептидов, причем отношение между количествами каких-либо двух аминокислот, равное целому числу, не служит доказательством гомогенности препарата. Эти расчеты становятся более ценными, когда имеются данные о гомогенности препарата, полученные другими методами, но точная молекулярная масса белка не известна. Тогда точное молярное отношение двух или более аминокислот дает возможность рассчитать молекулярную массу с некоторой достоверностью.
Использование кристаллизации как критерия гомогенности будет рассмотрено в следующем разделе; но и этот критерий не является однозначным.
В заключение этого короткого раздела следует сказать, что неэлектрофоретические методы не дают четких результатов и к тому же некоторые из них очень трудоемки. Тем не менее они могут использоваться для частичного изучения фермента в качестве дополнительных методов.
