Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Один из способов идентификации нужного фермента среди многих компонентов, разделившихся в процессе электрофореза,, состоит в специфическом окрашивании этого фермента. Естественно, такой способ можно применять только в тех случаях, когда электрофорез проводят в неденатурирующих условиях и, следовательно, он не пригоден для выявления ферментов после электрофореза в присутствии мочевины или ДСН. Кроме того, процедуру идентификации фермента следует проводить без предварительной фиксации белковых полос, и тем не менее используемые реагенты должны успеть продиффундировать в гель прежде, чем произойдет диффузия самого фермента. Наиболее удовлетворительные результаты дают те методы, в которых гель разрезается по толщине на тонкие пластины (рис. 9.6), благодаря чему полосы белков оказываются на поверхности и необходимость в длительной диффузии реагентов в гель отпадает. Лучше всего для этого подходят крахмальные или полиакриламидные (толстые) пластины после проведения простого гель-электрофореза, электрофореза в градиентных гелях и изоэлект-рического фокусирования.
Существует множество разновидностей этого метода, поэтому здесь будут кратко описаны только принципы, на которых основаны те или иные варианты. Гель можно обработать, погрузив его в раствор с реагентами, при условии что конечный продукт ферментативной реакции (краситель или осадок), который при этом выявляется, нерастворим и остается на месте своего образования. Если же окрашенный продукт, образовавшийся в том участке геля, где находится определяемый фермент, растворим, то он будет быстро диффундировать из геля в раствор с реагентами. Например, дегидрогеназы определяются по осаж-
328
Глава 9
Окрашивание на белок Специфическое окрашивание
ферментов
Рис. 9.6. Продольное разрезание пластины геля, позволяющее окрашивать белки в поверхностном слое геля.
дению нерастворимых восстановленных тетразолиевых красителей, причем их восстановление происходит под действием NAD(P)H, образующегося в месте локализации дегидрогеназы.
Согласно другой процедуре, реагенты частично иммобилизуются; для этого их вносят в раствор, полимеризующийся затем ¦с образованием геля (например, геля агара, который помещают на поверхность электрофоретического геля) или ими пропиты-.вают фильтровальную бумагу. В этих случаях можно локализовать сложную цепь реакций, инициируемых определяемым ферментом, так как даже тогда, когда видимый продукт растворим, •он не может быстро диффундировать наружу. Процессы, ана-.логичные тем, которые протекают при измерении ферментативной активности сопряженными методами (см. разд. 8.3), тоже можно использовать для локализации ферментов; так, образование или окисление NAD(P)H можно наблюдать в ближнем ультрафиолете (сине-зеленая флуоресценция). Для качественного обнаружения ферментов в геле часто применяют такие химические методы, которые обычно не используются для определения ферментативной активности в растворе. Например, освобождение фосфата под действием различных фосфатаз может быть замечено по появлению осадка фосфата кальция [192]. Если же этот осадок не очень отчетливо виден, то после отмывания избытка реагентов его можно превратить в фосфат евин-
Определение чистоты белков; кристаллизация
329
ца, дающий черные полосы в местах, где расположен активный фермент.
Представляя для печати результаты, полученные при определении чистоты ферментного препарата с помощью гель-электрофореза, важно дать какую-то количественную оценку содержания всех присутствующих в нем примесей. Заявление, что образец «дал одну полосу при электрофорезе», неубедительно, если количество нанесенного на гель белка было настолько мало, что получилась только одна слабо окрашенная зона. Желательно также представить какое-то подтверждение того, что окрашенная полоса — это действительно данный фермент, а не присутствующий в препарате другой белок, который в количественном отношении даже превосходит исследуемый фермент. В литературе часто встречаются примеры того, как совершенно ошибочно основная полоса, полученная при электрофорезе, без всяких доказательств приписывается очищенному ферменту, хотя на самом деле она относится к примеси. Если удельная активность выделенного препарата слишком низка, то количество данного фермента в нем может составлять всего лишь 1% общего содержания белка, и при гель-электрофорезе его вряд ли можно заметить. В этом случае могут помочь фотографии электрофореграмм, хотя на них обычно плохо воспроизводится картина распределения окраски по относительной интенсивности. Более надежные в этом смысле результаты дает сканирование окрашенного геля (рис. 9.7). При этом единственная оговорка, которую можно сделать, касается относительной интенсивности специфической окраски различных обнаруженных компонентов. Исходя из предположения, что все белки окрашиваются одинаково, можно произвести точное количественное определение всех компонентов, используя гель-сканирующее устройство.
Итак, аналитический гель-электрофорез является одним из наиболее широко применяемых в биохимической лаборатории
