Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
ческое фокусирование и ПАГЭ-ДСН). Таким образом, двумерный электрофорез не имеет значительных преимуществ при анализе очищенных препаратов.
Окрашивание белковых полос в геле и отмывка красителя
В этом разделе мы не намереваемся описывать все методические подробности, а хотим лишь обрисовать основные особенности используемых процедур. После проведения электрофореза зоны белков должны быть визуализированы. Этой цели служит процедура окрашивания, в которой обычно используется^ какой-нибудь органический краситель, прочно связывающийся с белками. Существует много пригодных для этого красителей. Они должны удовлетворять следующим требованиям: 1) обладать высокой чувствительностью, позволяющей определять малые количества белка и 2) интенсивность окраски должна быть, пропорциональна количеству белка независимо от его типа.. Большинство используемых красителей притягивается к положительно заряженным группам в молекулах белков (к остаткам лизина и аргинина); следовательно, белки с более высоким* содержанием таких групп — обычно это более основные белки — окрашиваются сильнее. В результате некоторые кислые полипептиды могут остаться незамеченными из-за слишком слабого* связывания красителя.
Перед окрашиванием белки необходимо фиксировать на носителе путем их денатурации в кислой среде (если они еще не денатурированы). Для фиксации обычно используют либо смесь метанол/уксусная кислота/вода в соотношении 3:1:6, либо» осадитель белка — трихлоруксусную кислоту, либо надхлорнук> кислоту в концентрации 5—10%. За исключением электрофоре-
-326
Глава 9
за в присутствии ДСН и изоэлектрического фокусирования, во всех остальных случаях краситель может быть включен в смесь для фиксации. Если гели содержат ДСН, то последний следует сначала отмыть, иначе белки не будут связывать краситель. Амфолиты также связывают краситель, и поэтому им надо дать возможность выйти из геля в процессе фиксации и только потом приступать к окрашиванию.
Окрашивание производится с использованием красителя, растворенного в фиксаторе. Существует много различных методов для преодоления встречающихся здесь трудностей, связанных со скоростью окрашивания ({132, 183—189]; ссылками на эти работы отнюдь не исчерпывается вся литература по данному вопросу). В качестве красителей широко используются амидно-черный, нигрозин, кумасси синий G-250 и кумасси синий R-250. Последний особенно часто применяется для окрашивания белков, хотя он хуже окрашивает некоторые кислые белки по сравнению с амидно-черным. Кумасси синий обычно проявляет более высокую чувствительность, чем другие красители. В некоторых методах (см., например, [189]) красители не применяются, а используется свойство додецилсульфата калия или натрия выпадать в осадок на холоду. В белковых полосах содержится меньше свободного детергента, чем в промежуточных участках геля, поэтому полосы кажутся более прозрачными по сравнению с молочно-белым фоном. Этим методом можно быстро получить результаты после гель-электрофореза в присутствии ДСН, но он недостаточно чувствителен. Успешно использовалось также предварительное мечение белков флуо-рескамином '[190]. В этом случае денатурированные белки можно наблюдать (в содержащем ДСН геле) в ходе электрофореза по их флуоресценции в ближней УФ-области спектра.
Отмывка несвязанного красителя из геля может занимать много времени. Процедура окрашивания должна быть достаточно длительной, чтобы краситель мог проникнуть в середину геля, после чего избыток красителя удаляют. Продолжительность окрашивания и отмывки красителя очень сильно зависит от толщины геля — поэтому в современных методах прослеживается тенденция использовать гели толщиной до 1 мм и меньше. Следует отметить, что в крахмальных гелях, которые после фиксации становятся непрозрачными, окраска белковых зон регистрируется только в очень тонком поверхностном слое геля, поэтому вся процедура окрашивания и отмывки излишка красителя занимает лишь несколько минут.
Недавно был предложен псевдофотографический метод окрашивания белковых зон серебром, который обладает большей чувствительностью, чем окрашивание кумасси синим. Он состоит в том, что после фиксации белки в геле обрабатываются
Определение чистоты белков; кристаллизация
32 Г
нитратом серебра, так что серебро связывается с белками (нестехиометрически) ; затем следуют этапы восстановления и усиления окраски; в результате весь процесс завершается за несколько часов [191]. Этот способ особенно полезен, когда для анализа доступны лишь очень малые количества образца. Вследствие того что процедура окрашивания происходит в более мягких условиях, наблюдается меньшая деформация геля, а следовательно, и полос белка.
Предельная чувствительность достигается введением радиоактивной метки в исследуемый образец. После фиксации (обычно путем замораживания геля) полосы белков, содержащие чрезвычайно малые их количества, можно детектировать с помощью методов радиоавтографии в любое удобное для исследователя время.
Специфическое окрашивание ферментов
