Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 128

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 122 123 124 125 126 127 < 128 > 129 130 131 132 133 134 .. 145 >> Следующая

Определение чистоты белков; кристаллизация
323
Электрофорез в градиентных гелях
Это четвертый электрофоретический метод, который также широко используется в настоящее время. Он сходен с гель-электрофорезом в присутствии ДСН в том отношении, что белки в данном случае также разделяются только в соответствии с их размерами, а не по величине зарядов i[182]. Концентрация акриламида изменяется по длине пластинки от самого высокого значения (обычно около 30%) в нижней ее части до всего лишь 3% в верхней. Буфер выбирается с высоким значением pH, так что в большинстве своем белки мигрируют в геле к аноду (вниз). Электрофорез длится до тех пор, пока каждый белок не достигнет такого участка в геле, где из-за слишком малых размеров пор он уже не сможет двигаться дальше. Например, небольшие белки могут дойти до участка, содержащего 25% ак-риламида, а крупные останутся вблизи старта (верхняя часть геля). Как и в системе с ДСН, при электрофорезе в градиентном геле можно определить размеры молекул, если прокалибровать гель с помощью смеси стандартных белков. Однако в данном случае эти размеры будут относиться к нативным белкам, а не к их субъединицам. Система электрофореза в градиентном геле сходна со следующим, пятым методом — изоэлектрическим ‘фокусированием: процесс продолжается до тех пор, пока не прекратится перемещение всех белков и пока не завершится «фокусирование», или концентрирование, диффузных белковых зон, я результате чего будет достигнута очень высокая степень разрешения.
Изоэлектрическое фокусирование
Принципы изоэлектрического фокусирования были описаны в разд. 5.3. Распространенным методом с высокой разрешающей 'способностью является аналитическое изоэлектрическое фокусирование на пластинах полиакриламидного или агарозного геля. Компоненты смеси разделяются в соответствии с их изоэлект-рическими точками, и полосы сужаются вследствие «фокусирующего» эффекта. Гель служит только стабилизирующей средой, которая не должна замедлять миграцию крупных белков. Поскольку необходимо, чтобы все молекулы в конце концов достигли положения, соответствующего их изоэлектрической точке, среда не должна оказывать сопротивления их движению из-за слишком большой вязкости. Из полиакриламидных гелей наиболее предпочтительны крупнопористые. Однако с ними трудно обращаться, а иногда вследствие неравномерной полимеризации получаются неоднородные гели. Если представляющие интерес белки имеют довольно небольшие размеры
324
Глава 9
(<100 kD), то лучше использовать 5—6%-ный полиакриламидный гель. В противном случае более подходящим материалом будет агароза, которая при концентрации всего лишь 2% (вес/объем) дает твердые крупнопористые гели.
В один гель можно внести несколько образцов, причем неважно, в каком месте они будут внесены, так как каждый компонент в итоге дойдет до соответствующего ему положения в градиенте pH. Концентрация амфолита обычно выбирается в диапазоне 2—4%. Фирмы производят уже готовые гели, содержащие амфолиты; после достижения равновесия получаются воспроизводимые результаты, соответствующие предсказанным градиентам pH. В процессе фокусирования проводимость амфо-литов приближается к нулю, что дает возможность использовать высокие потенциалы (100—200 В/см) без слишком большого перегрева. Это способствует быстрому фокусированию, так что весь процесс может завершиться часа за два.
Одна из проблем изоэлектрического фокусирования состоит в том, что некоторые белки связываются с компонентами амфо-литов, а это приводит к изменению изоэлектрической точки комплекса по сравнению с изоэлектрической точкой свободного белка. В результате могут появиться дополнительные слабые полосы, так как сами амфолиты тоже представляют собой дискретные компоненты. Таким образом, хотя наличие одной полосы при изоэлектрическом фокусировании служит хорошим критерием гомогенности, появление нескольких более слабых полос еще не свидетельствует об истинной гетерогенности белкового препарата.
Двумерные системы
Двумерный гель-электрофорез широко используется как аналитический метод. Он заключается в том, что полоску геля, содержащую белки, разделенные, например, с помощью изоэлектрического фокусирования, накладывают на кромку пластины другого геля, содержащего ДСН. Электрофорез проводится в направлении, перпендикулярном длинной оси полоски первого геля (рис. 9.5). Окончательные результаты разделения зависят от того, что в первом направлении белки разделяются в соответствии с их изоэлектрическими точками, а во втором — в соответствии с размерами субъединиц. Неочищенные клеточные экстракты в двумерных системах могут давать до 1000 индивидуально детектируемых белковых компонентов. Однако для анализа очищенного фермента необходимо проводить лишь одномерный электрофорез в каждой из двух систем (изоэлектри-
Определение чистоты белков; кристаллизация
32&
Изоэлектрическое фокусирование
Старт
Электрофорез в присутствии ДСН
Рис. 9.5. Аналитический двумерный гель-электрофорез.
Предыдущая << 1 .. 122 123 124 125 126 127 < 128 > 129 130 131 132 133 134 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed