Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Существуют по крайней мере пять различных электрофоретических процедур, в которых полиакриламидный гель используется как среда.
Простой электрофорез
Он проводится в буфере с таким pH, при котором разделяемые белки сохраняют стабильность и нативную форму молекул. Этот метод был первым, в котором были использованы различия как в заряде белков, так и в их размерах. Хотя выбор буфера определяется природой белков, чаще всего используют слабощелочные буферные растворы с pH 8—9; в этих условиях большинство белков заряжено отрицательно и движется к аноду. Анод обычно расположен в нижней части геля. Следует отметить, что в этих системах не предусмотрено разделение белков, движущихся в противоположном направлении (рис. 9.1 и и 9.2), т. е. основные белки в данном случае переходят в катодный буфер и утрачиваются для анализа. Поэтому если известно, что большинство исследуемых белков являются основными,
Определение чистоты белков; кристаллизация
319
то необходимо, чтобы используемый буфер имел более низкое значение pH, а катод располагался в нижней части геля.
Концентрацию полиакриламида можно варьировать в широких пределах в зависимости от размеров фракционируемых молекул. Возможны два варианта: изменение общего содержания акриламида и изменение концентрации соединения, образующего поперечные сшивки (Ы,Ы'-метиленбисакриламида). Каждый из этих вариантов преследует приблизительно одну и ту же цель, так как при повышении концентрации одного из этих двух реагентов размеры пор уменьшаются, в результате чего перемещение более крупных молекул еще более замедляется. Для белков с очень большими размерами, вплоть до 106 дальтон, можно приготовить крупнопористый гель, содержащий 3—4% акриламида и 0,1% бисакриламида, хотя с ним довольно трудно работать. Для очень низкомолекулярных белков размерами около 104 дальтон можно применять гель, содержащий 15% акриламида и 1% (или меньше) бисакриламида. При высоком содержании соединения, образующего поперечные сшивки, гель становится мутным. Нормальным является соотношение, когда на
1 часть сшивающего агента берется 20—50 частей мономера (акриламида). Обычно используются гели, содержащие 7—10% акриламида. Полимеризацию инициируют, добавляя к раствору свежеприготовленный персульфат аммония (1,5—2 мМ) вместе с веществом, захватывающим свободные радикалы; для этого обычно используют ТЕМЭД (0,05—0,1 % по объему, Ы,1М,1\т',М'-тетраметилэтилендиамин). Вместо химической полимеризации можно провести фотополимеризацию с помощью рибофлавина. При этом получаются гели с меньшим количеством активных примесей. При комнатной температуре гель образуется примерно в течение 30 мин. Более подробные сведения о буферных растворах, устройстве аппарата для электрофореза и методах работы можно найти в инструкциях фирм-изготовите-лей.
Простой электрофорез можно также проводить в крахмальном геле. Крахмал по своим свойствам и поведению при геле-образовании отличается меньшим постоянством по сравнению с акриламидом. Однако до того, как полиакриламидные системы получили широкое распространение, крахмальный гель был очень популярен. Его и теперь охотно применяют для определения ферментативной активности после электрофореза; пластину крахмального геля легко разрезать пополам по толщине: одну половину окрасить на белки, а другую использовать для определения ферментативной активности (см. рис. 9.6). Из-за того что крахмальные гели мутные, зоны окрашенных белков видны лишь на поверхности, поэтому для надежного детектирования количество разделяемых белков должно быть больше,
320
Глава 9
чем при использовании прозрачных гелей, в которых хорошо* видны зоны окрашенных белков по всей глубине геля.
Простой электрофорез в агарозных гелях обладает меньшей разрешающей способностью, чем электрофорез в мелкопористых гелях, поэтому он менее пригоден для определения чистоты образца на основе его гомогенности.
Гель-электрофорез в присутствии мочевины
Этот метод особенно полезен для белков, нерастворимых при низкой ионной силе, используемой при электрофорезе. Он заключается в том, что белки в денатурированном состоянии подвергают электрофорезу в присутствии 6—8 М мочевины. Вначале образец растворяют в мочевине, чтобы полностью денатурировать все его компоненты. Обычно при этом добавляют немного меркаптоэтанола, который предотвращает образование дисульфидных связей между полипептидными цепями. В этих условиях белки разделяют в соответствии с величиной их зарядов и размерами субъединиц. Для этого вида электрофореза характерны те же ограничения, что и для электрофореза в отсутствие мочевины.
Крахмальные гели, содержащие мочевину, тоже дают удовлетворительные результаты при электрофорезе, и с ними легче работать, чем с полиакриламидными гелями. Хотя крахмальные гели в присутствии мочевины прозрачны, они становятся мутными после удаления мочевины во время их окрашивания и отмывания. Поэтому окрашенные зоны белков видны только на поверхности гелей.
Гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН)
