Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Этот краткий обзор некоторых из наиболее распространенных методов определения количества белка дает представление
о существующих возможностях. Каждый метод имеет свои достоинства и недостатки, которые суммированы в табл. 8.4. Цель очистки ферментов состоит в том, чтобы удалить как можно больше белка, сохранив при этом ферментативную активность; успех каждой стадии зависит как от сохранения общей активности фермента, так и от степени повышения его удельной активности, выраженной в единицах активности на миллиграмм белка.
Подробные рецепты приготовления некоторых реактивов, используемых при определении белка, приведены в приложении Б.
ГЛАВА 9
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСТОТЫ БЕЛКОВ; КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ
9.1. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Наиболее полное разделение смеси белков на индивидуальные компоненты достигается с помощью электрофоретических методов. Как уже обсуждалось в разд. 5.2, проведение препаративного электрофореза, несмотря на то что он обладает значительными теоретическими преимуществами, сопряжено с большими трудностями. Поэтому он используется не часто. В аналитическом же варианте электрофорез — это один из наиболее широко применяемых методов исследования. Действительно, чтобы охарактеризовать очищенные препараты белков, их теперь почти обязательно подвергают электрофоретическому анализу. Для проведения аналитического электрофореза в гелях требуется всего 5—25 мкг белка; это обычно не слишком значительная часть полученного препарата. До того как были предложены гелевые системы, электрофоретический анализ проводили в аппарате Тизелиуса методом движущейся границы. Хотя для этого приходилось расходовать десятки миллиграммов белка, разделения очень сходных белков не достигалось и -анализ каждого образца требовал больших усилий и внимания. Затем был разработан аналитический электрофорез на бумаге и других целлюлозных материалах, используемых в качестве носителей, что исключило два из указанных выше недостатков метода Тизелиуса; количество необходимого для анализа белка значительно сократилось и проводить электрофорез стало намного легче, так как для этого метода требуется только простое оборудование. Однако разрешение осталось примерно таким же, как и прежде, даже при использовании обладающих хорошими качествами современных ацетатцеллюлозных пленок; это объясняется тем, что разделение компонентов смеси происходит в соответствии только с приблизительной величиной отношения заряд/размер и многие белки движутся вместе в виде одной зоны (ср. с разд. 5.2).
Когда Смитис [128] впервые применил в качестве поддерживающей среды крахмальный гель, степень разрешения сразу же повысилась. Из-за небольших размеров пор в этом геле (по сравнению с порами в бумаге, гелях агара и в других ранее
Определение чистоты белков; кристаллизация
317
Рис. 9.1. Система диск-электрофореза в геле. Каждый белковый компонент отделяется в виде диска в трубке с полиакриламидным гелем.
использовавшихся материалах) перемещение крупных молекул сильно замедляется. Это результат кажущегося повышения вязкости среды: эффективная вязкость зависит от размеров молекул. Кроме того, благодаря снижению диффузии очень резкие зоны обнаруживаются даже после проведения электрофореза в течение ночи. Несколькими годами позже Орнстейн [129] предложил синтетическую гелевую среду — поперечно-сшитый полиакриламид. Применение этого материала дает возможность получать более контролируемые, чем у крахмального геля, размеры пор. Он обладает также и некоторыми другими достоинствами. Первоначально электрофорез в полиакриламидном геле назывался «диск-электрофорезом», потому что была распространена система, в которой образцы, помещенные в отдельные трубочки с гелем, разделялись на белковые зоны, имеющие форму дисков (рис. 9.1). Хотя этот вариант по-прежнему широко используется, он все более вытесняется электрофорезом на пластинах геля, который позволяет разделять одновременно несколько нанесенных рядом друг с другом образцов, что дает возможность непосредственно сравнивать подвижности компонентов разных образцов. В последние годы большое распространение получил тонкослойный гель-электрофорез на полиакриламидных пластинах. При этом были преодолены .технические трудности, связанные с приготовлением однородных по толщине и больших по площади пластин геля, а также с необходимостью вносить в стартовые канавки геля большое количество образцов. В результате эта система стала такой же простой, как диск-электрофорез, но более производительной. Сейчас выпускается множество разновидностей приборов для тонкослойного гель-электрофореза, при этом толщина слоя геля может быть меньше 1 мм (рис. 9.2). Одно из преимуществ тонкослойного
318
Глава 9
Рис. 9.2. Современный прибор для тонкослойного гель-электрофореза. Образцы вносят в канавки, сделанные в геле с помощью специальной «гребенки». Эта система позволяет сравнивать образцы, расположенные рядом друг с другом.
геля состоит в том, что он характеризуется более низким тепловыделением на 1 см2 его поверхности при данном напряжении электрического поля. Кроме того, при окрашивании полос белка и удалении избытка несвязанного красителя последний гораздо быстрее диффундирует в тонкий слой геля и из него.
