Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 124

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 118 119 120 121 122 123 < 124 > 125 126 127 128 129 130 .. 145 >> Следующая

Измерение активности ферментов
313
ка, измеренную пробу ъ&ожно вновь смешать с основным белковым раствором.
Измерение оптической плотности в далекой УФ-области спектра (вблизи полосы поглощения пептидных групп) используется как значительно более, чувствительный метод, существенно менее зависимый от аминокислотного состава белков [175, 176]. Из-за поглощения кислорода в далекой ультрафиолетовой области с помощью обычных спектрофотометров нельзя измерить поглощение пептидных групп в максимуме при 192 нм. Однако измерения на краю полосы поглощения дают удовлетворительную точность, если величина оптической плот-ности составляет не менее 0,5. Коэффициенты экстинкции белков (1 мг в 1 мл раствора) примерно равны:
Значение коэффициента экстинкции при 206 нм включено в перечень, поскольку эта длина волны используется в приборах типа «Увикорд 3» фирмы LKB.
Приведенные выше значения варьируют от белка к белку вследствие того, что ароматические и другие остатки вносят разный вклад в поглощение в этой области и, кроме того, вторичная структура (а-спираль, (5-конформация и т. д.) влияет на контур и точное положение максимума поглощения пептидных групп. Анализ возможных вариаций показал, что наиболее разумные значения получаются вблизи 205 нм [175]. Коэффициенты экстинкции почти для всех белков при этой длине волны укладываются в пределы 28,5—33. Введя поправку на содержание тирозина и триптофана (путем определения оптической плотности также и при 280 нм), коэффициент экстинкции при 205 нм можно определить с ошибкой не более 2% с помощью следующей формулы [177]:
Так как величина 205 нм близка к предельным значениям длин волн, при которых еще можно проводить измерения на обычных спектрофотометрах, определение белка при этой длине волны требует использования очень чистых кювет, достаточно новой дейтериевой лампы и буферов с минимальным поглощением. Многие соли поглощают при этой длине волны. Среди обычных анионов исключение составляют сульфат и перхлорат. Можно использовать слабый фосфатный буфер (5 мМ, pH 7,0) в присутствии 50 мМ сульфата натрия (эта соль помогает иа-
220 нм 11
215 нм 15
210 нм 20
206 нм 29
205 нм 31
200 нм 45
Пик при — 192 нм 60
?20.1 *¦«¦/“' = 27,0 + 120 X ¦
^205
21—1078
314
Глава 8
бежать адсорбции белка на стенках кюветы). Наиболее удобный спектрофотометр устанавливается на нуль с помощью буфера (3 мл), затем добавляют 1—10 мкл образца, содержащего от 2 до 50 мг/мл белка, и отмечают величину оптической плотности. Если известен состав буфера в образце белка, то такое же количество этого буфера следует добавить в контрольную кювету. Фактически все обычно используемые буферы сильно поглощают при 205 нм, но, в силу того что они разбавляются примерно в тысячу раз, их влияние на поглощение оказывается очень небольшим. Для разбавленных растворов белков поглощение буфера относительно выше и использование этого метода может быть практически нецелесообразным. Если достаточно менее точной оценки содержания белка (±10%), то можно использовать значение Е2051 мг/мл = 31. При определении количества белка по отношению величин оптической плотности при 280 и 205 нм для измерения A2so следует использовать более концентрированные растворы белка и вводить соответствующий множитель в приведенное выше уравнение.
Таблица 8.4. Относительные достоинства и недостатки некоторых общеупотребительных методов определения количества белка
Метод
Необходимое количество белка, мг
Зависимость Деструкция от аминобел ков кислотного
состава
Примечания
Биуретовая реак- 0,5—5 Да ция
Низкая
Щелочной реактив; ЫН4+-ионы мешают определению; быстрое развитие окраски
Метод Лоури 0,05—0,5 Да
Поглощение при 0,05—2 Нет
280 нм
Умеренная
Значитель-
ная
Медленное развитие окраски
Поглощающие в УФ вещества мешают определению; ответ получают немедленно
Поглощение при 205 нм Связывание красителя
0,01—0,05 Нет 0,01 — 0,05 Да
Низкая
То же
Умеренная Кислый реактив;
окрашенные вещества сорбируются на стекле; быстрое развитие окраски
Измерение активности ферментов
315
Связывание красителей
Этот метод [178, 179] стал в последнее время очень распространенным, поскольку он Отличается большей чувствительностью и не меньшей точностью, чем метод Лоури; кроме того, вся процедура не занимает много времени. Основная проблема чисто техническая: красители собираются на стенках стеклянной посуды и в кюветах (а также на коже!), что делает их довольно неприятными реактивами. При растворении кумасси синего G-250 в надхлорной кислоте он дает красно-коричневую окраску, но при связывании его с белком в том же растворе окраска становится синей. Метод заключается просто в добавлении образца белка к реактиву и измерении окраски при 595 нм. Рекомендуется использование одноразовых кювет, однако адсорбированный краситель можно быстро удалить, промыв кюветы разбавленным раствором додецилсульфата натрия. Образовавшаяся окраска в определенной степени зависит от состава белка, и поэтому для точного определения белков нужно построить калибровочную кривую, используя соответствующую смесь белков.
Предыдущая << 1 .. 118 119 120 121 122 123 < 124 > 125 126 127 128 129 130 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed