Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 123

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 117 118 119 120 121 122 < 123 > 124 125 126 127 128 129 .. 145 >> Следующая

Иногда полезно приблизительно знать, как обстоит дело в отношении содержания белка, однако часто достаточную информацию можно получить исходя из своего предшествующего опыта — по количеству осадка, по высоте пиков и т. д. Нет никакой настоятельной необходимости точно знать содержание белка на всех стадиях.
Этот вводный параграф включен в данный раздел, чтобы показать, что очистку фермента можно проводить рутинным способом, совсем не измеряя содержание белка или измеряя его лишь в конечном препарате. Определение количества белка в ходе самого фракционирования нужно делать только в том случае, если знание концентрации белка имеет решающее значение для процесса очистки. Если же это не важно, то можно отобрать небольшие пробы и определить в них белок позже.
Теперь мы опишем несколько доступных методов определения белка. Некоторые из них, требующие специальной аппаратуры (определение азота по Кьельдалю, рефрактометрия), исключены из рассмотрения. К наиболее широко применяемым методам относятся: 1) биуретовая реакция с использованием щелочного раствора соли меди; 2) метод Лоури с применением реактива Лоури—Фолина—Чиокалто; 3) измерение оптической плотности в УФ-области спектра при 280 нм (полоса поглощения ароматических групп) или при 205—220 нм (полоса поглощения пептидных групп); 4) связывание красителей.
Каждый из этих методов имеет свои достоинства и недостатки, но важно отметить, что ни один метод, за исключением взвешивания сухого белка, не дает однозначных и точных резуль-
Измерение активности ферментов
311
татов в пределах нескольких процентов, если только он не калиброван по белковому раствору того же состава. Практически это означает, что истинно ^точное измерение можно провести лишь для чистых белков, по&ле того как метод будет стандартизирован; для этого определяют сухой вес этих чистых белков и строят соответствующую калибровочную кривую. Однако если белок содержит небелковые простетические группы, углеводы или нуклеиновые кислоты, то определение сухого веса дает значение для всей молекулы, а не для ее белковой составляющей. Далее излагаются принципы четырех перечисленных выше методов.
Биуретовая реакция
В этой реакции используется сильнощелочной раствор солей меди, который дает пурпурную окраску с белками. Основная причина, по которой эта реакция широко не используется, — это ее низкая чувствительность. Для надежного определения нужно израсходовать несколько миллиграммов образца. Метод отличается точностью, так как выход по окраске мало меняется от белка к белку. Это связано с тем, что реактив взаимодействует с пептидной цепью, а не с боковыми группами. Аммиак мешает определению, так как образует комплекс с медью; поэтому в применении к фракциям, полученным путем осаждения сульфатом аммония, этот метод не дает точных результатов. Более высокая чувствительность биуретовой реакции может быть достигнута, если измерять концентрацию медьбелкового комплекса не при 540 нм, а при 310 нм, в ближней ультрафиолетовой области спектра [170]. К сожалению, при использовании этого метода необходимо ставить несколько контрольных проб, чтобы исключить поглощение посторонних веществ в этой области длин волн, из-за чего он и не нашел широкого применения.
Метод Лоури
Наиболее часто цитируемая работа в биохимической литературе— это работа Лоури, Розеброу, Фарра и Рэндалла [171], в которой был описан новый метод определения белков. Было обнаружено, что при сочетании биуретовой реакции и реакции с применением реактива Фолина—Чиокалто [172] белки, содержащие тирозин, дают интенсивную темно-синюю окраску. В оригинальной работе приведены концентрации реактивов для получения идеальных результатов. С тех пор появилось множество модификаций этого метода, в которых в основном сделаны попытки устранить влияние некоторых специфических веществ.
312
Глава 8
К сожалению, многие соединения, используемые при очистке ферментов, влияют на эту реакцию, поэтому необходимы различные модификации метода, чтобы преодолеть все препятствия. Вместе с тем метод отличается довольно высокой чувствительностью, так как дает хорошую окраску с белками, концентрация которых составляет ОД мг-мл^1 и ниже; мешающие вещества чаще всего оказываются разбавленными до такого уровня, что их влияние становится незначительным. Подробный обзор метода и многих его модификаций опубликован в статье [173].
Поглощение в УФ-области спектра
Этот способ стал использоваться для определения количества белка с тех пор, как Варбург и Христиан {174] сообщили о методе, основанном на измерении оптической плотности при 260 и 280 нм, что позволяет ввести поправку на содержание в препаратах нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Такая поправка очень важна, когда работают с сырыми экстрактами, но становится менее существенной по мере очистки белков и удаления мешающих веществ. В этом случае достаточно просто определить оптическую плотность при 280 нм. Белки поглощают при 280 нм единственно из-за присутствия в их молекулах остатков тирозина и триптофана (если только они не содержат поглощающих в УФ-свете простетических групп). Так как содержание этих двух аминокислот в белках очень сильно варьирует, коэффициент поглощения, выражаемый обычно как ?2801% или Е2В01 мг/мл, также варьирует в значительной степени. У большинства белков величина ?,28о1мг/мл лежит в интервале 0,4—1,5, но имеются белки, занимающие по этому показателю крайние положения в ряду всех известных белков — это некоторые пар-вальбумины и сходные с ними Са2+-связывающие белки (0,0), с одной стороны, и лизоцим (2,65) — с другой. Поглощение при 280 нм дает лишь приблизительное представление об истинном содержании белка; исключение составляют чистые белки. Если точно известен коэффициент экстинкции чистого белка (он должен быть стандартизирован относительно сухого веса или по крайней мере относительно поглощения при 205 нм — см. ниже)* то величина поглощения при 280 нм позволяет точно определить его содержание. По существу, это самый точный метод для определения чистых белков, поскольку в этом случае не требуется производить с ним никаких манипуляций, за исключением соответствующего разбавления. Разумеется, растворитель не должен поглощать при 280 нм, а если он поглощает — необходим точный контрольный опыт. Во время измерений белки не подвергаются никаким вредным воздействиям и не разрушаются, поэтому, хотя для точного определения нужно около 1 мг бел-
Предыдущая << 1 .. 117 118 119 120 121 122 < 123 > 124 125 126 127 128 129 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed