Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Методика определения:
Налейте 1 мл реактива А в кювету,
добавьте 20 мкл исходного 1 М раствора глюкозы («реактив В»),
измерьте А34о в контрольной пробе,
добавьте образец (0,2—ИЮ мкл), измерьте увеличение Аз40-
Гексо- . киназа
Глюкоза + АТР—----Глюкозо-6-Р + ADP
Глюкозо-6-Р-дегидрогеназа
6-Р-глюконат
(Глюкозо 6-Р-дегидрогеназа из Leuconostoc mesenteroides может использовать NAD вместо NADP, что может быть экономически более выгодным.)
Если глюкоза содержится в «реактиве А», а АТР используется как «реактив В», то глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа медленно окисляет глюкозу и к концу дня поглощение раствора возрастает. Этого можно избежать, если АТР включить в «реактив А» и добавить туда глюкозу в последнюю минуту. Следует отметить, что если не используются очень лабильные соединения, то реактив А не следует хранить во льду; его температура должна быть близка к температуре, при которой проводится тестирование, чтобы на установление температурного равновесия в кювете уходило меньше времени. Это не относится к периодическим методам, так как в этом случае можно легко провести короткую предынкубацию. Контроль температуры в спектрофотометрах может быть осуществлен с помощью кюве-тодержателя с циркулирующей водой. Этот способ позволяет достаточно точно контролировать температуру, однако следует помнить две вещи. Во-первых, истинная температура в уравновешенной кювете может несколько отличаться от установленной в термостате температуры циркулирующей воды из-за потерь тепла на пути от термостата к кювете. Во-вторых, требуется около 10 мин, чтобы холодный раствор в кювете нагрелся до
Измерение активности ферментов
309
температуры, отклоняющейся от равновесной не более чем на
0,5 °С. Это, конечно, создает определенные неудобства, и поэтому растворы лучше предварительно проинкубировать при нужной температуре. Из-за этих двух моментов обычно удобнее в текущей работе проводить измерения при комнатной температуре, регистрируя истинную температуру в кювете и вводя поправку на отклонение от стандартной температуры с помощью соответствующего коэффициента. При отклонении температуры в пределах 5°С от стандартной (25 °С) поправка в 6% на градус является приемлемой средней величиной для многих ферментов (см. разд. 8.1). Не следует терять много времени на определение точного поправочного коэффициента для каждого фермента; достаточно протестировать один и тот же образец при нескольких температурах.
Заключительная стадия — это добавление фермента к смеси, содержащей все ингредиенты и выдержанной при подходящей температуре. Если препарат фермента обладает очень низкой активностью, то объем добавляемого образца может составлять 20% и больше от конечного объема смеси, тогда как концентрированные растворы высокоактивных ферментов приходится разбавлять в тестируемой смеси иногда в миллион раз. Шприцы на 1 мкл позволяют отмеривать пробы объемом всего лишь 0,5 мкл с ошибкой в 1—2%, но при отмеривании меньших объемов ошибки измерения неизбежно получаются больше. Необходимо иметь под рукой набор шприцев общим объемом от 1 до 100 мкл, с тем чтобы нужный объем жидкости был отмерен с оптимальной точностью. Если нужно взять пробу объемом менее 0,5 мкл, в повседневной практике можно использовать самые маленькие шприцы объемом до 0,1 мкл или даже меньше, имея, однако, в виду, что точность будет низкой. Надежные измерения должны проводиться с использованием образцов, объем которых 'составляет не меньше половины объема, измеряемого с минимальной ошибкой. Это означает, что образец обычно необходимо разбавлять. Разбавление следует проводить с максимальной точностью, так как эта стадия представляет собой дополнительный источник ошибок. Один из способов разбавления состоит в том, что к 1100 мкл образца добавляют 0,9, il ,9, 4,9 или 9,9 мл буфера, отмеренные калиброванной пипеткой; при этом получают разбавление.соответственно в 10, 20, 50 или 100 раз. Важен состав буфера, используемого для разбавления. Концентрация белка в образце может быть уже весьма низкой, и, чтобы избежать инактивации или адсорбции белка, следует добавить инертный белок. Обычно используется бычий сывороточный альбумин, растворенный в буфере для разбавления в концентрации около ;1%. Сам буфер должен быть оптимальным в отношении стабильности фермента.
310
Глава 8
Если условия, обеспечивающие стабильность фермента, не известны, следует сначала взять буфер с pH 7, например фосфатный, содержащий ионы магния (1—2 мМ) и небольшое количество ЭДТА (0,1 мМ). Буфер для разбавления фермента можно хранить месяцами, если добавить в него 5 мМ азида натрия.
8.5. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА
Все ферменты представляют собой белки, поэтому полезно знать общее количество присутствующего белка на каждой стадии фракционирования. Еще важнее — следить за активностью фермента; количество белка можно измерить и позже, если в этом возникнет необходимость. Точное определение количества белка нужно: 1) когда стадия фракционирования сильно зависит от концентрации белка; 2) когда необходимо убедиться в том, что данная стадия приводит к удалению значительного количества нежелательных белков; 3) при тестировании удельной активности на предпоследней или последней стадии; 4) чтобы проиллюстрировать в отчете ход очистки.
