Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Упрощение техники разделения эмбрионов обусловлено в основном двумя причинами: 1) отказом от техники заключения в агар и использования временных реципиентов; 2) исключением этапов по извлечению из блестящей оболочки и ретрансплантации в нее оперированных эмбрионов.
В качестве исходного материала для получения однояйцевых близнецов в последнее время используют 5,5—8-дневные, эмбрионы на стадии ранней морулы-бластоцисты.
При разработке оптимальных условий получения монозиготных близнецов большое внимание уделялось продолжительне-сти культивирования in vitro после разделения и трансплантации половинок эмбрионов, а также их хранению в замороженном состоянии. Установлено, что продолжительность культивирования половинок эмбрионов более 4 ч снижает результативность их последующей приживляемости. Культивирование in vitro половинок эмбрионов крупного рогатого скота в течение 24 ч снижает их приживляемость примерно в три раза, по сравнению с культивированием in vitro в течение 4—6 ч.
Разделенные эмбрионы коров могут храниться в замороженном состоянии.
Клонирование эмбрионов путем пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки. Несмотря на то, что разработанная техника разделения эмбрионов на половинки явилась значительным шагом в повышении возможности размножения животных и улучшения их генетического потенциала, она имеет целый ряд ограничений в клонировании животных: а) методом разделения эмбрионов клонируется не высокопродуктивный родитель, а его потомок, хозяйственно полезные признаки которого еще неизвестны; б) максимальное получение особей на один эмбрион ограничено тремя — четырьмя новорожденными; в) последовательное разделение эмбрио-240
нов сопровождается формированием структуры бластоцист меньшего размера с уменьшением числа клеток.
Если бластомеры кролика были отделены после третьего, четвертого или пятого деления на 8-, 16- или 32-клеточной стадии и культивировались индивидуально in vitro, то формировались бластоцисты (без внутренней клеточной массы) меньшего размера. Среднее число клеток в этих бластоцистах было 29, 16 и 7, что составляло около %, ‘/16, '/;J2 числа клеток эмбрионов, не подвергнутых манипуляции (среднее число клеток 244).
После пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеиро-ванные яйцеклетки ядро репрограммируется таким образом, что начинает развиваться новый эмбрион. Теоретически все бластомеры из эмбриона донора имеют одну и ту же генетическую основу и, таким образом, способны обеспечить развитие идентичных особей. Эмбрионы, развившиеся после пересадки ядер, в свою очередь, могут быть использованы как доноры ядер. После нескольких генераций создается возможность получения сотен и даже тысяч идентичных эмбрионов.
Клонирование эмбрионов путем пересадки ядра включает три основных этапа: выделение интактного ядра донора, энуклеацию ооцита, пересадку ядра в энуклеированную яйцеклетку. В отличие от амфибий пересадка ядра у млекопитающих не стимулирует ооцит. Поэтому требуется четвертый этап — активация ооцита и слияние мембран яйца и ооцита. Под действием электрического импульса происходят активация ооцита и слияние мембран между ядром клетки донора и энуклеирован-ным ооцитом-реципиентом. Технология пересадки ядер клеток способствовала успешному получению клонированных живых кроликов, мышей, овец, коз, крупного рогатого скота и свиней. Было показано, что только эмбрионы на предимплантационной стадии являются тотипотентными, но эффективность этой технологии пока низка. У крупного рогатого скота была продемонстрирована следующая эффективность этой технологии на каждом этапе (%): энуклеация — 70—80, развитие морулы-бласто-цисты клонированных эмбрионов — 20—30 и выживаемость до получения потомства — 20—30. В исследованиях К.Р. Вондиоли (1991) 190 эмбрионов с пересаженными ядрами были получены из одного эмбриона путем многократной пересадки ядер из последовательно клонированных эмбрионов. Однако последовательные пересадки ядер после четвертого цикла сопровождались высокими эмбриональными потерями в матке. В итоге не
удалось получить телят от пересадки эмбрионов, полученных после третьего цикла клонирования.
При использовании в качестве доноров ядер более продвиг-нутых в развитии эмбрионов крупного рогатого скота 6-дневно-го возраста (47—68 бластомеров), по сравнению с использованием малоклеточных эмбрионов (около 30 бластомеров), достигается более высокая эффективность слияния бластомера и ооцита, дробления эмбрионов и развития до стадии бластоцисты (В.И. Захарченко и др., 1996). Число клонированных бластоцист, полученных от эмбрионов одного и того же возраста, более продвигнутых в развитии, значительно выше, чем от менее продвигнутых. Эффективность развития клонированных эмбрионов крупного рогатого скота выше при использовании в качестве источника бластомеров морул на стадии прекавита-ции. При этом свежевымытые морулы являются лучшими донорами ядер, чем развившиеся in vitro.
Широкомасштабное клонирование эмбрионов крупного рогатого скота было проведено двумя коммерческими фирмами в США и Канаде. В первом случае ядра-доноры получили от 32—64-клеточных эмбрионов, а во втором — от 8—64-клеточных. В обоих случаях ооциты брали от телок с вызванной суперовуляций через 24—48 ч после начала охоты, а эмбрионы извлекали нехирургическим способом. Все реконструированные ооциты с пересаженными ядрами культивировали в лигатиро-ванных яйцеводах овцы в течение 4—5 дней в США и 5—7 дней в Канаде до пересадки их постоянному реципиенту. В Канаде 128 (42,4 %) коров-реципиентов из 302 стали беременными на 35-й день от начала охоты, 14 (4,6%) абортировали до 90-го дня беременности, 4 (1,3%) абортировали между 6,5-м и 8-м месяцами беременности. Из оставшихся 110 (36,4%) беременных коров-реципиентов 10 погибли из-за неблагоприятных условий содержания, а 100 принесли живых телят. В США часть эмбрионов, нормально развивавшихся в яйцеводе овцы, были использованы в качестве доноров в последующих циклах пересадки ядер. Результаты этого эксперимента (табл. 4.9) показали, что эмбрионы, полученные в результате множественных генераций, имеют низкую степень слияния и небольшое число клеток, развившихся до морулы-бластоцисты. Однако циклическая пересадка ядра эмбрионов обеспечивает получение нормальных эмбрионов, содержащих такое же число клеток в последующих генерациях. Из эмбрионов с трансплантированными ядрами первой и третьей генераций были получены телята. 242
