Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
яцевод для временного культивирования половинок эмбриона до стадии поздней морулы и бластоцисты. Выживаемость половинок эмбриона на этой стадии развития после пересадки ре-ципиентам составила около 50%. Уменьшение выживаемости половинок по сравнению с пересадкой нормальных эмбрионов у овец может вызвать механическое повреждение эмбрионов во время удаления агара перед трансплантацией постоянному ре-ципиенту. Однако эти эксперименты дали основание автору заключить, что единичные бластомеры из 2-клеточного эмбриона имеют потенциальные возможности к развитию и получению нормального потомства.
У овец 2-клеточные эмбрионы можно получить только в течение очень короткого периода времени. Лишь единичные дробящиеся эмбрионы извлекают у овец раньше чем за 48 ч после начала охоты, а через 60 ч после начала охоты большинство эмбрионов находятся на 4-клеточной стадии развития. Ввиду значительных колебаний интервалов времени между инъекцией СЖК и началом охоты, началом охоты и началом овуляции, между первой и последующей овуляциями почти невозможно добиться того, чтобы хирургическое извлечение эмбрионов у определенной овцы проводилось в тот момент, когда все эмбрионы находятся на 2-клеточной стадии. Последующие эксперименты показали, что одинаковые двойни могут быть также получены из 4- и 8-клеточных эмбрионов разделением бластомеров на две группы (С.М. Вилладсен, 1980). Половинки из 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов так же жизнеспособны, как и нормальные эмбрионы овец. Их можно хранить в замороженном состоянии, что позволило применить их в эксперименте для получения монозиготных двоен разного возраста.
Выживаемость четвертей эмбрионов клетки или 8-клеточных эмбрионов на четыре пары клеток ниже, чем нормальных. Несмотря на это, получили одну группу монозиготных четвертных и несколько пар монозиготных двоен. Выживаемость эмбрионов, полученных из отдельных бластомеров 8-клеточных эмбрионов, почти нулевая. Понижение выживаемости, по-видимо-му, связано с уменьшением числа клеток у таких эмбрионов во время бластуляции, что способствует формированию трофоэк-тодермальных пузырьков в большей степени, чем нормальной бластоцисты.
Установлено, что бластоцисты, полученные из половинок эмбрионов, состоят из 32 клеток, т. е. составляют лишь 50% нормального числа клеток. Отдельные бластомеры из 4-клеточного эмбриона также способны развиться в бластоцисту. Однако бластоциста из такой четверти состоит из 16 клеток и меньше. 238
Четверть эмбриона, полученная из пары бластомеров 8-клеточ-ного эмбриона, развивается в бластоцисту, не отличающуюся от той, которая образуется из одного бластомера 4-клеточного эмбриона. Обе категории четвертей эмбрионов имеют пониженную выживаемость, н только около 50% из пересаженных развиваются до приплода.
На 8-клеточной стадии каждый бластомер имеет потенциальную возможность развиваться в бластоцисту, но очень маленького размера, примерно из восьми клеток. При пересадке таких бластоцист менее 10% из них развиваются до стадии рождения.
На основе этих исследований можно предположить, что резкое уменьшение числа клеток эмбриона является основным фактором, понижающим способность этих эмбрионов развиваться в жизнеспособные бластоцисты, хотя стадия развития, на которой происходит разделение, имеет малое значение.
После того как для эмбрионов большинства животных заканчивается компактизация морулы, защита со стороны зоны пеллюциды становится несущественной. Поэтому последующие разработки по получению монозиготных двоен были направлены на использование поздних морул и бластоцист.
В настоящее время применяют простую технику разделения эмбрионов на различной стадии развития (от поздней морулы до вылупившейся бластоцисты) на две равные части одновременно с разрезом зоны пеллюциды. При этом не выявлена существенная роль присутствия зоны пеллюциды для эффективности развития разделенных бластоцист.
Использование эмбрионов на более поздних стадиях развития у крупного рогатого скота для получения однояйцевых близнецов облегчается тем, что их извлекают нехирургическим способом.
При пересадке эмбрионов от доноров с положительной реакцией на вирус лейкоза крупного рогатого скота (БЛВ) получают телят с отрицательной реакцией.
Простая Техника разделения разработана и для 6-дневных эмбрионов свиней. При этом стеклянной иглой разрезают внутреннюю клеточную массу эмбриона и примерно 40% зоны пеллюциды. Затем разрезают слой трофоэктодермы внутри зоны пеллюциды. Одну половинку эмбриона в собственной зоне пеллюциды, а другую без зоны пеллюциды пересаживают в рог матки 6-дневного реципиента на расстоянии 5 см от маточно-трубного соединения.
Техника разделения на половинки эмбрионов успешно применяется на овцах и на козах.
Деление на стадии поздней бластоцисты считается более удобным, так как блестящая оболочка тоньше и цитоплазма эластичнее, чем у ранней бластоцисты.
Совершенствование способов получения монозиготных близнецов проходило по пути их упрощения. Если в ранних экспериментах для удаления зоны пеллюциды, разделения и обратной пересадки оперированных эмбрионов требовалось четыре и даже шесть инструментов, то в дальнейшем те же задачи успешно решали с помощью трех — удерживающей пипетки, микроскальпеля и инъекционной пипетки, двух — удерживающей пипетки и стеклянной микроиглы и даже одного инструмента—стеклянной микроиглы или микроскальпеля.
