Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Полученные результаты открыли перспективы повышения выхода живых спермиев из одной дозы размороженной спермы, так как появилась возможность проведения процедуры всплывания спермиев с одним и тем же осадком несколько раз без потери их жизнеспособности. Действительно, при пятикратной смене среды над осадком спермы с разбавителем удается получить такую же концентрацию живых спермиев, как и при первом ее добавлении (табл. 4.7). Причем их оплодотворяющая способность при последующих сменах сред хотя и понижается (число дробящихся эмбрионов при трехкратной смене среды составляет 47% против 65% в начальной среде), но остается полноценной (табл. 4.8).
Т а б л и ц а 4.7. Число всплывших спермиев после добавления свежей
порции среды
Кратность смены среды Число опытов Число спермиев в 1 мл
1 5 (2,1 ±0,21)-106
2 6 (1,8+0,20)- 10ь
3 6 (1,1 ±0,28)-106
4 5 (2,1+0,42)-10ь
6 6 (2,0±0,34)-106
Таблица 4.8. Влияние смены среды на оплодотворяющую способность
спермы
Кратность смены Число ооцитов Чнло дробящихся Число морул и
среды зародышей бластоцист
I 253 164 (65,0)” 34 (21,0)"
3 220 103 (47,0)’ 21 (20,3)’*
Примечание. В скобках приведены значения в процентах.
Таким образом, используя прием многократных смен среды, можно в несколько раз (в наших опытах в пять раз) увеличить эффективность использования одной порции эякулята, что особенно важно, когда применяют сперму от высокоценных бы« ков-производителей.
Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий раз~ вития эмбрионов. Оплодотворение яйцеклеток у млекопитающих осуществляется в яйцеводах. Это затрудняет доступ исследователя к изучению условий среды, где происходит процесс оплодотворения. Поэтому система оплодотворения in vitro была бы ценным аналитическим инструментом для изучения биохимических и физиологических факторов, включающихся в процесс успешного соединения гамет. Более того, предполагалось, что эта система найдет применение в технологии разведения животных.
Основным критерием для установления оплодотворения является образование первого и второго полярного тельца, мужского и женского пронуклеусов и обнаружение некоторых частей сперматозоида.
Крупный рогатый скот. Первый теленок с использованием метода оплодотворения in vitro был получен Б.Г. Бра-кетт и др. в 1982 г. Авторы использовали ооциты из предовуля-торных фолликулов или яйцеводов сразу после овуляции. Капа-цитацию сперматозоидов проводили в среде с высокой ионной силой. Другие группы ученых (Л.К- Эрнст и др., 1983; М.И. Прокофьев и др., 1987) в последующие годы получили телят оплодотворением in vitro ооцитов, созревших вне организма.
Было установлено, что эмбрионы крупного рогатого скота и овец, культивируемые in vitro с 1—4-клеточной стадии, редко развивались дальше 8—16 клеток, тогда как эмбрионы, культивируемые с 8—16-клеточной стадии, успешно развивались до
*Р < 0,05
**Р > 0,05.
стадии бластоцисты. Эти наблюдения позволяют предположить существование блокировки развития на 8—16-клеточной стадии для эмбрионов крупного рогатого скота.
Можно предполагать, что яйцевод, а не культуральная среда обеспечивает условия, ведущие к развитию ранних эмбрионов, что определенные процессы развития, происходящие между одно- и 16-клеточной стадиями, требуют специфических условий, обычно обеспечиваемых яйцеводом.
Начало разработке адекватной системы культивирования эмбрионов in vitro положено сокультивированием эмбрионов на слое эпителиальных клеток яйцеводов. Для сокультивирования с ранними эмбрионами используются также кумулюсные клетки и трофобласты.
Применяют следующую схему оплодотворения in vitro и культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота. Оплодотворение in vitro проводят в капле модифицированной среды Тироида. После созревания in vitro ооциты частично очищаются от окружающих экспандированных кумулюсных клеток и переносятся в микрокапле по 5 ооцитов в каждой. Суспензия сперматозоидов объемом 2—5 мкл добавляется к среде с ооци-тами, чтобы достичь концентрации сперматозоидов в каплях 1 —1,5 млн/мл. Через 44—48 ч после осеменения определяют наличие дробления ооцитов. Затем эмбрионы помещают на монослой эпителиальных клеток для дальнейшего развития в течение 5 дней.
Овцы. Оплодотворение у овец исследовали двумя путями: in vitro и введением фолликулярных ооцитов в яйцевод осемененной овцы. Как и у крупного рогатого скота, число оплодотворенных яйцеклеток было больше в том случае, когда фолликулярные и овулировавшие ооциты помещали в яйцевод со спермиями. При использовании системы оплодотворения in vitro таких клеток было меньше.
А. Троунсон и P.M. Мур (1977) культивировали ооциты внутри фолликулов, а затем помещали их в яйцевод осемененного реципиента. В результате от 26 до 50% ооцитов развивались до стадии бластоцисты. После пересадки полученных бластоцист другому реципиенту приживаемость составила 52%.
