Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
ных ные шие шиеся
дроб бласто
ление цисты
1 Без кумулюса 69 57 49 7 1(1,9)
2 Без кумулюса с допол 78 60 50 4 6
нительными фоллику (10,0)
лярными клетками
(5• 10*’ клеток в I мл)
3 С кумулюсом (10ь кле 83 60 52 7 1 (1,8)
ток в I мл)
4 С кумулюсом и фолли 86 78 34 15 29
кулярными клетками (37,2)
(5* 10s клеток в 1 мл)
Примечание. В скобках приведены значения в процентах.
кумулюсом позволило достичь развития эмбрионов до вылупившейся бластоцисты у 37,2% ооцитов.
В другом опыте культивирование ооцитов с кумулюсом и слоем гранулезных клеток как целостного комплекса обеспечило дальнейшее развитие до бластоцисты 42,6% клеток. Добавление фолликулярных клеток к этому комплексу существенно не повлияло на эффективность их дальнейшего развития. В результате пересадки этих бластоцист эмбриональная выживаемость составила 63%.
Необходимость прямого контакта между соматическими (фолликулярными) клетками и половыми клетками обусловлена целым рядом причин. Фолликулярные клетки играют важную роль в питании ооцита. Они обеспечивают энергетический субстрат ооциту, участвуют в переносе некоторых предшественников аминокислот, нуклеотидов и фосфолипидов в ооцит; генерируют инструктивные сигналы, которые влияют на ядро и прямой синтез определенных структурных белков. Инструктивные сигналы, требуемые для созревания ооцитов, как было показано выше, наиболее важны в первые 6—8 ч после инициации.
В настоящее время применение на практике пока нашло созревание in vitro только ооцитов крупного рогатого скота. Ооциты получают из яичников коров после убоя животных и
путем прижизненного извлечения, 1—2 раза в неделю. В пер-вом случае яичники берут от животных после убоя, доставляют в лабораторию в термостатированном контейнере в течение
1,5—2,0 ч. В лаборатории яичники дважды промывают свежим фосфатным буфером. Ооциты извлекают из фолликулов, диаметр которых 2—6 мм, путем отсасывания или разрезания яичника на пластинки. Ооциты собирают в среду ТСМ199 с добавлением 10% сыворотки крови от коровы в охоте, затем дважды промывают и отбирают для дальнейшего созревания in vitro только ооциты с компактным кумулюсом и однородной цитоплазмой.
В последнее время разработан способ прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора или лапароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр которых не менее 2 мм, 1—2 раза в неделю от одного и того же животного. В среднем получают однократно 5—6 ооцитов на животное. Менее 50% ооцитов пригодны для созревания in vitro.
Несмотря на низкий выход ооцитов, при каждом извлечении возможность многократного использования животного, с учетом информации о происхождении полученных ооцитов, открывает новые перспективы использования метода оплодотворения in vitro в практических целях.
Отобранные ооциты с компактным кумулюсом созревают в течение 24 ч в среде ТСМ 199 с добавлением 20%-ной обработанной теплом сыворотки крови от коровы в охоте, гранулезных клеток (3—5* 10h клеток в 1 мл) и небольшого количества антибиотиков (50 и. е. пенициллина, 50 мкг стрептомицина на 1 мл). Гранулезные клетки собирают из среды, в которой ооциты отделяют от фолликулов и центрифугируют дважды по 5 мин при 500 g. Осадок гранулезных клеток суспендируется в среде для созревания. Сокультивирование ооцитов и гранулезных клеток проводят при 38,5° С в атмосфере 5 % С02 в чашках Петри в 2 мл среды.
Капацитация сперматозоидов. Важным этапом в разработке метода оплодотворения у млекопитающих было открытие явления капацитации спермиев. В 1951 г. М.К. Чанг и одновременно с ним Г.Р. Аустин установили, что оплодотворение у млекопитающих наступает только в том случае, если спермии ¦ течение нескольких часов до овуляции находятся в яйцеводе животного. Основываясь на наблюдениях по изучению проник^ новения спермиев в яйцеклетки крысы в различные сроки после спаривания, Аустин ввел термин капацитация. Оа 230
означает, что в спермин должны произойти некоторые физиологические изменения до того, как он приобретет способность к оплодотворению.
В последующих исследованиях в лаборатории М.К. Чанга были не только определены оптимальные условия капацитации спермиев в половом тракте самки, но и продемонстрирована возможность декапацитации спермиев кролика, извлеченных из матки, обработанной семенной плазмой кролика, человека и быка, рекапацитации этих спермиев при внесении их в яйцеводы и, наконец, удаления декапацитирующего фактора из семенной плазмы центрифугированием.
