Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
разрыв зародышевого пузырька происходит примерно через 5 ч после выброса ЛГ, ооцит достигает метафазы I через 12 ч и метафазы 11 — через 24—25 ч. Вне организма ядерная мембрана зародышевого пузырька крупного рогатого скота также исчезает через 5—6 ч, через 12 ч хромосомы достигают метафазы I и через 20—24 ч — метафазы II.
Видовые различия в проявлении мейотического созревания ооцитов у коров, овец и свиней показаны в табл. 4.3.
Таблица 4.3. Временные параметры реакции (мейоза) ядра ооцитов разных видов животных на предовуляторный выброс гонадотропинов
(Хантер, 1980)
Вид живот Латентный Стадии мейотического созревания, ч
метафаза 1 аиафаза телофаза метафаза II
Корова 10---12 14---21 22 23 24
Овца 10---11 12---20 21 22 24
Свинья 17---18 26---34 35 36 37
Хотя большинство ооцитов, извлеченных из фолликулов яичников, возобновляют мейоз и достигают метафазы II, оплодотворение их часто не обеспечивает полноценного развития зародышей. Предполагают, что основной причиной этого является неполноценное созревание ооцитов. Одной из причин может быть то, что при созревании ооцита in vitro в цитоплазме не вырабатывается в достаточной мере фактор, контролирующей формирование и развитие мужского пронуклеуса. Считают, что для появления в цитоплазме ооцита фактора, вызывающего созревание мужского пронуклеуса, необходимо обеспечить индуктивное влияние нормального окружения ооцита в фолликуле в течение не менее 6 ч после начала мейотического созревания.
Это было подтверждено в опытах по оплодотворению in vitro ооцитов свиней, извлеченных из фолликулов на разных стадиях мейоза. С прогрессированием стадии развития в момент извлечения ооцита из фолликула повышался процент нормально оплодотворенных зародышей: нормальное оплодотворение имело место у 31,7; 51,6 и 78,2% культивируемых ооцитов со стадии зародышевого пузырька, диакинеза и метафазы I соответственно.
Установлено, что стероидные гормоны не требуются для запуска мейоза у млекопитающих, но необходимы для полного физиологического созревания ооцита.
В связи с тем, что стероидные гормоны и другие факторы, вырабатываемые фолликулярными клетками, оказывают влияние на созревание ооцитов, было сделано предположение, что культивирование ооцитов с фолликулярными клетками может повысить их способность к нормальному оплодотворению и последующему эмбриональному развитию. Многие явления внутри фолликула, включая биосинтез стероидов и синтез белков, регулируют гонадотропные гормоны. Поэтому при культивировании ооцитов внутри фолликулов или с фолликулярными клетками гонадотропины должны быть обязательной составной частью среды.
Эффективное использование всего названного комплекса в составе культуральной среды, включая фолликулярные клетки, гонадотропины и острогены, было продемонстрировано при созревании ооцитов овец in vitro' (Р.Б. Стайгмиллер, P.M. Мур; 1984).
Чтобы выяснить роль фолликулярных клеток в созревании ооцитов авторы культивировали ооциты с фолликулярными клетками (без кумулюса, с кумулюсом или с кумулюсом и фолликулярными клетками, табл. 4.4). Культивирование проводили в среде М199 с 10%-ной инактивированной фетальной сывороткой, гонадотропинами (10 мкг ЛГ/мл, 10 мкг ФСГ/мл и 10 мкг пролактина/мл) и эстрадиолом-17(3 (1 мкг/мл). Ооциты культивировали 24 ч при 37° С в среде при медленном покачивании в воздухе с 5% С02. После культивирования ооциты пересаживали в яйцевод осемененной овцы в охоте. Свежую сперму (0,01—0,02 мл) вводили перед пересадкой ооцитов в оба рога матки. Эмбрионы извлекали из матки через 10—12 дней и классифицировали по категориям: одноклеточные, задержка дробления (2—16 клеток), задержка морулы (от 16 клеток до неполной бластоцисты) и вылупившаяся бластоциста.
Как видно из табл. 4.4, культивируемые in vitro ооциты без кумулюса не способны к дальнейшему развитию. Из полученных в первой группе одна задержавшаяся морула и одна бластоциста принадлежат, вероятно, реципиентам. Добавление фолликулярных клеток в среду для культивирования ооцитов без кумулюса не улучшило способность ооцитов к дальнейшему развитию — 83% ооцитов остались одноклеточными. Полученные в этой группе шесть бластоцист в одном опыте, по мнению авторов, возможно, являются результатом неполного удаления кумулюса. Ооциты с кумулюсом (группа 3) подобно ооцитам без кумулюса (группа 2) в 87% случаев остались на однокле-: точной стадии. Добавление фолликулярных клеток к ооцитам с 228
Т а б л и ц а 4.4. Культивирование ооцитов, выделенных из фолликулов и созревших в присутствии различного числа фолликулярных клеток
Число ооцитов Развитие зародышей
на 12-й день
Груп Ооциты переса извле одно задер вылу
па жен ченных клеточ жав пив
