Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
У сердцевинной паренхимы табака (СПТ) отсутствие цитокининов в питательной среде блокирует клеточный цикл в пре-митотическом периоде. Поэтому, если в питательной среде присутствует только ауксин, клетки не делятся и после четырехдневной латентной фазы переходят к росту растяжением. Одни цитокинины без ауксинов приводят к такому же старению тканей СПТ, как и на среде без гормонов. Приведенные данные, полученные для СПТ, не всегда могут объяснить всех случаев, когда каллусная ткань получается на среде с одним гормоном,
Рис. 1.1. Получение культуры каллус-ной ткани нз различных эксплантов: фрагментов стебля, корня, листа, лепестков, тычинок
например, каллусообразование на среде с 2,4-Д без цитокини-нов у незрелых зародышей пшеницы или получение каллуса на семядолях подсолнечника на среде с цитокининами, но без ауксинов. Установлено, что результаты во многом зависят от эндогенных гормонов, содержащихся в клетках того или иного экс-планта, т.е. связаны с особенностями их гормонального статуса.
Имеются новые представления, согласно которым не ауксины и цитокинины, а полисахариды и какие-то другие индукторы вызывают деление клеток, приводящие к образованию каллуса.
Процесс перехода к каллусному росту в базальной части апекса начинается с остановки клеточных делений. Лаг-фаза продолжается 24—48 ч. В течение этого времени клетки увеличиваются в размерах и ткань разрыхляется. После окончания лаг-фазы клетки начинают быстро делиться, образуя каллус-ную ткань. Таким образом, если дедифференцировка специализированной клетки связана с индукцией деления под влиянием фитогормонов, то дедифференцировка делящейся меристемати-ческой клетки связана с остановкой делений, деспециализацией клетки и только после этого — с индукцией делений, приводящей к каллусообразованию.
Эффект, вызываемый действием одних и тех же фитогормонов, может быть различным в зависимости от физиологической характеристики ткани-мишени. Компетентность ее в рассмотренных примерах определяется степенью дифференцировки клеток.
Переход клетки in vitro из дифференцированного состояния к дедифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов (эпигеномной изменчивостью). Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа. У двудольных растений процесс репрессии и дерепрессии генов, лежащий в основе дедиф-ференцировки, происходит легче, чем у однодольных.
При переходе дедифференцированной клетки к неорганизованному анархическому размножению, приводящему к образованию каллусной ткани, в клетках происходят биохимические и цитологические изменения. Дедифференцировка начинается с использования запасных веществ и разрушения специализированных клеточных органелл. Через 6—12 ч после индукции де-дифференцировки клеточная оболочка разрыхляется и разбухает, увеличивается число свободных рибосом, возрастает число элементов аппарата Гольджи, увеличиваются размеры и число
ядрышек. Все эти изменения предшествуют началу делений, которые начинаются через 48—72 ч.
Следует учитывать, что в клетках экспланта в начале культивирования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызванные как дедиффе-ренцировкой, так и травматическими синтезами. Для разделения этих процессов лучше проводить прединкуба-цию экспланта на безгормональной среде 3—б сут.
Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего наступает старение и отмирание клетки. Каллусную дифференцировку можно назвать вторичной, но ее не следует путать со вторичной диффе-ренцировкой клетки, лежащей в основе морфогенеза.
Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток, первичный каллус, возникающий на эксплантах, через 4—6 недель переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассированием. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет.
Ростовая кривая каллусных клеток имеет S-образную форму (рис. 1.2). Такой характер роста легко обнаружить у суспен-зиозных культур каллусных клеток. Кривая роста включает пять фаз. Во время 1-й латентной или лаг-фазы увеличения числа или массы клеток не происходит. Клетки в этот период подготавливаются к делениям. Следующая, 2-я фаза—логарифмическая или экспоненциального роста — характеризуется наибольшей митотической активностью и увеличением массы кал-лусной культуры, кроме того, рост происходит с ускорением. 3-я фаза — линейная, в которой скорость роста клеток постоянна. Далее наступает 4-я фаза — замедленного роста, когда митотическая активность клеток резко снижается. В следующей — стационарной 5-й фазе ростовая кривая выходит на плато. В этот период начинается деградация клеток, однако она еще уравновешивается возрастанием числа клеток за счет их деления; в целом же скорость нарастания клеточной массы
