Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Ыа2ЭДТА 37,3 37,3 20,0 37,3
FeS04 • 7НгО 27,95 27,-85 15,0 27,8
NaH2P04 *Н20 --- 150 --- 90
Компоненты питательной Концентрация, мг/л
Мурасн- Гамборга Шен Грес-
г» - Скуга ка - Хнль- хофф - Доу
дебрандта
НзВОз 6,2 3,0 5,0 3,0
MnS04 • 4Н20 22,3 10,0 10,0 10,0
ZnSO* * 7Н20 8,6 2,0 1,0 3,0
KI 0,83 0,75 1,0 0,75
N а2МоС>4 -2Н20 0,25 0,25 0,1 0,25
CuS04•5Н20 0,025 0,025 0,2 0,25
CoU2 * 6НгО 0,025 0,025 0,1 0,25
Глнцнн 2,0 --- --- 2,0
Мезоннознт 100 100 1000 10
Никотиновая кислота 0,5 1,0 5,0 1,0
Пнрндокснн-Н1 0,5 1,0 0,5 0,1
Тнамнн-Н1 1 10,0 5,0 0,1
2,4-Д --- ai---j,o --- ---
Кннетнн --- 0,1 0,1 ---
Глутамин --- --- --- 2,0
Сахароза 30 000 30 000 30000 20 000
Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар, который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей.
С целью рационального использования времени растворы солей макро- и микроэлементов, а также витаминов и фитогормонов готовят более концентрированными, что позволяет многократно их использовать. Концентрированные (маточные) растворы хранят в холодильнике.
Условия культивирования. Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные условия выращивания. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеют хлоропластов и питаются гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани, такие, как каллусная ткань мандрагоры. В некоторых случаях каллусные ткани, не способные к авто-трофному питанию, все же выращивают на непрерывном освещении, что является необходимым условием дальнейшего успешного морфогенеза, как у люцерны. Большинство же каллусных тканей получают в темноте или при рассеянном свете.
Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далее культивируют их при освещенности 1000—4000 лк.
Культивирование изолированных меристем и их микроразмножение также происходит на свету. Освещенность факторостатной (световой) комнаты должна составлять в зависимости от культуры 1000—10 000 лк. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта.
Влажность в культуральной комнате должна составлять 60—70%. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой.
ОпФимальная температура для большинства культивируемых тканей 25—26° С, для культуры тканей тропических растений она может достигать 29—30° С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18—20° С.
Наилучшие световой и температурный режимы, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер.
1.3. КУЛЬТУРА КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙ
Культура изолированных тканей обычно бывает представлена каллусными или реже — опухолевыми тканями. Каллусная культура — это неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллусные, т.е. становятся особым образом дифференцированными. Каллус, что означает «мозоль», может образовываться как на изолированных кусочках ткани (эксплантах) in vitro, так и на растении при поранении.
Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого цвета. Очень редко она может иметь интенсивную зеленую окраску (у мандрагоры). Темно-коричневая окраска возникает чаще при старении каллус-ных клеток и связана с накоплением в них фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от них в питательные среды вносят антиоксиданты.
Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции: 1) рыхлой, состоящей из сильно оводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мелкие агрегаты; 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами; 3) плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.
Обязательным условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее в каллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению, а цитокинины — пролиферацию (деление) дедифференциро-ванных клеток (рис. 1.1). Если в питательную среду без гормонов поместить кусочек стебля, листа, корня (без верхушки) или любой другой растительный эксплант, состоящий из специализированных (дифференцированных) клеток, то деления клеток не произойдет и каллусная ткань не образуется. Это связано с неспособностью дифференцированных клеток к делению. Каждая клетка проходит три фазы роста: 1) деление; 2) растяжение; 3) диф-ференцировку. Характерной чертой заключительной фазы роста является утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря клеткой способности к делению. Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их дедифференцировка, т.е. клетки как бы возвратились в меристематическое состояние. Размножение дедифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла в процессе диффе-ренцировки.
