Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Только одна из трех эукариотических РНК-полимераз, а именно РНК-полимераза II, транскрибирует гены, которые затем будут транслированы в белки. Две другие полимеразы катализируют образование различных типов РНК, которые составляют часть белок-синтезирующего аппарата: РНК-полимераза I синтезирует высокомолекулярную рибосомную РНК, а РНК-полимераза III — разнообразные низкомолекулярные стабильные РНК, в том числе тРНК и рибосомную 5S-PHK. Специфическим ингибитором РНК-полимеразы II является — ама-тин — высокотоксичное вещество, получаемое из бледной поганки. Вполне естественно, что эти три фермента узнают на ДНК различные сигнальные участки, в частности последовательности, инициирующие синтез РНК.
Клетки высших эукариот содержат около 40 000 молекул РНК-полимеразы II, примерно такое же число молекул РНК-полимеразы I и около 20 000 молекул РНК-полимеразы III, причем точное число этих ферментов варьирует в зависимости от скорости роста клеток.
Особые РНК-полимеразы обеспечивают транскрипцию ДНК клеточных органелл эукариот — хлоропластов и митохондрий. РНК-полимераза хлоропластов имеет сходство с бактериальным ферментом. РНК-полимеразы митохондрий состоят, по-видимому, всего из одной субъединицы и сходны по аминокислотной последовательности с РНК-полимеразами некоторых бактериофагов. Ген, кодирующий митохондриальную РНК-по-лимеразу, располагается в ядре.
Цикл транскрипции можно разделить на четыре основных стадии, каждая из которых включает множество элементарных событий: 1) связывание с ДНК; 2) инициация цепи РНК; 3) рост (элонгация) цепи РНК; 4) терминация цепи РНК (см. рис. 2.13).
Этот цикл у бактерий осуществим в простой бесклеточной системе, состоящей из ДНК-матрицы и очищенной РНК-полимеразы, без каких бы то ни было вспомогательных факторов. В клетке в транскрипции участвуют разнообразные регуляторные белки, выполняющие вспомогательные функции, и изучение транскрипции в бесклеточной системе позволяет понять не только ферментативные механизмы синтеза РНК, но и дает ключ к пониманию механизмов транскрипции.
У эукариот транскрипция изучена хуже, и это, в частности, связано с тем, что эукариотические РНК-полимеразы не способны осуществить полный цикл транскрипции в бесклеточной системе. Однако в основных чертах цикл транскрипции у эукариот и бактерий сходен.
Цикл транскрипции начинается с присоединения РНК-поли-меразы к промотору — строго определенному участку ДНК, определяющему место начала синтеза РНК. Оказавшись на промоторе, РНК-полимераза образует с ним так называемый закрытый промоторный комплекс, в котором ДНК сохраняет двуспиральную структуру. В закрытом комплексе РНК-полимераза не может начать транскрипцию, кроме того, он нестабилен и легко диссоциирует при повышении ионной силы.
Закрытый комплекс может обратимо превращаться в открытый. При этом РНК-полимераза расплетает примерно один виток двойной спирали ДНК в районе стартовой точки — нуклеотида, с которого начнется комплементарное копирование матрицы. В открытом комплексе связь РНК-полимеразы с ДНК существенно упрочняется.
Следующая стадия, инициация, осуществляется при наличии субстратов РНК-полимеразы, нуклеозидтрифосфатов и состоит в образовании первых нескольких звеньев цепи РНК. Первый нуклеотид входит в состав цепи, сохраняя свою трифосфатную группу, а последующие присоединяются к З’-ОН-группе предыдущего с освобождением пирофосфата. Таким образом, рост цепи РНК идет в направлении 5’ —> 3’, как при синтезе ДНК, а РНК-полимераза движется по матричной цепи в направлении 3’-> 5’. На стадии инициации продукт связан с матрицей и с РНК-полимеразой непрочно и с высокой вероятностью может высвобождаться из комплекса. В этом случае РНК-полимераза, не покидая промотора, снова инициирует РНК. Когда РНК-про-дукт достигает длины 3—9 нуклеотидов (в зависимости от промотора), транскрибирующий комплекс стабилизируется и уже не распадается до тех пор, пока синтез молекулы РНК не завершится. Примерно в этот момент ст-субъединица отделяется от фермента и начинается стадия элонгации.
Эффективность инициации на разных промоторах, их «сила», существенно различается: с некоторых промоторов за период деления клетки может инициироваться всего одна-две молекулы РНК, тогда как в других инициациях может происходить каждые одну-две секунды. Сила большинства промоторов увеличивается с ростом степени отрицательной сверхспирали-зации ДНК, поскольку при этом облегчается расплетение ДНК
и, как следствие, переход из закрытого в открытый промоторный комплекс.
На стадии элонгации в ДНК расплетено около 18 н. п. Примерно 12 нуклеотидов матричной нити ДНК образует гибридную спираль с растущим концом цепи РНК. По мере движения
РНК-полимеразы по матрице впереди нее происходит расплетение, а позади — восстановление двойной спирали ДНК. Одновременно происходит освобождение синтезированной РНК из комплекса с матрицей и с РНК-полимеразой. Эти перемещения должны сопровождаться относительным вращением РНК-полимеразы и ДНК, и не исключено, что в транскрипционный комплекс входят топоизомеразы, предотвращающие такое вращение.
