Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
руемый этим ферментом, определяется соотношением рибонук-леотидов в инкубационной смеси, а их последовательность близка к случайной.
Первым синтезированным полирибонуклеотидом был поли (Y). Его получили при инкубации концентрированного раствора УДФ в присутствии фермента. Оказалось, что при добавлении поли (Y) в бесклеточную систему синтеза белка синтезируется исключительно полифенилаланин. Так в 1961 г. был расшифрован первый кодон. Вскоре было показано, что поли (А) вызывает синтез полилизина, а поли (Ц)—полипролина. Поли (Г) в качестве матрицы не работает, так как образует сложную спиральную структуру.
Определение состава кодонов с помощью случайных сополимеров. Следующим шагом в расшифровке генетического кода было использование в качестве матриц полирибонуклеоти-дов, синтезированных в присутствии двух рибонуклеотиддифос-фатов, причем последние были взяты в разной пропорции. В такой смеси синтезируется матрица, содержащая все кодоны, которые могут быть образованы в данной системе, но различные кодоны присутствуют с разной частотой в зависимости от соотношения предшественников в реакционной смеси. Например, случайный сополимер У и Г содержит восемь различных триплетов (табл. 2.1) и их относительная частота зависит от соотношения У и Г в смеси.
Таблица 2.1. Генетический код
Первое по* Второе положение в кодоне Третье по
ЩТ) С A G
U(T) иии иси UAU UGU U(T)
Phe исс Туг Cys С
иис Ser UAC UGC А
UUA UCA UAA Терм G
Ley UCG Терм UGA
UUG UAG UGG Trp
с сии CCU CAU CGU U(T)
CUC ССС His CGC С
Ley Pro CAC Arg А
CUA CCA CAA CGA G
CUG CCG Gin CGG
CAG
А AUU ACU AAU AGU U(T)
AUC Ие ACC Asn Ser С
AUA Thr AAC AGC А
AUG Met АСА AAA AGA G
ACG Lys Arg
. AAG AGG
1
Первое по Второе положение в кодоне Третье по
ЩТ) С А С
G GUU GCU GAU GGU U(T)
GUC GCC Asp GGC с
Val Ala GAC Gly А
GUA GCA GAA GGA G
GUG GCG С1у GGG
GAG
Анализ аминокислотного состава синтезированных в присутствии матрицы полипептидов показывает относительную частоту включения той или иной аминокислоты. Сопоставление частоты образования разных кодонов и включения разных аминокислот дает информацию о нуклеотидном составе кодонов, но не о последовательности нуклеотидов в кодоне. Например, из данных табл. 2.1 был сделан вывод, что валин, лейцин и цисте-ин кодируются кодонами, содержащими 2У и 1 Г, а триптофан и глицин — 1У и 2Г.
В результате использования различных сополимеров из двух и трех нуклеотидов был установлен состав кодонов для каждой из аминокислот.
Использование сополимеров с заданной последовательностью. Сочетая методы органической химии и ферментативные методы Г. Корана, удалось синтезировать полирибонуклеотиды с определенной повторяющейся последовательностью. Были синтезированы сополимеры, в которых многократно повторяется последовательность из двух, трех и четырех оснований. Использование таких матриц для синтеза полипептидов в бесклеточной системе дало возможность установить точную корреляцию между кодонами и аминокислотами в полипептиде. Например, сополимер, в котором повторяется последовательность из двух нуклеотидов У и Г, содержит два чередующихся кодона УГУ и ГУГ (см. рис. 2.11, б). При использовании такой матрицы синтезировался полипептид, в котором валин сочетался с цистеином. Этот результат однозначно подтверждает триплетность генетического кода и в сочетании с данными, полученными другими методами, дает возможность точно идентифицировать кодоны для валина и цистеина (УГУ и ГУГ соответственно).
Если матрица состоит из повторяющейся последовательности из трех оснований, то в зависимости от рамки считывания можно получить три равных гомополипептида (см. рис. 2.11, б). Например, на матрице поли (УУГ) синтезировались полифенилаланин, полисерин и полилейцин. В сочетании с другими экспери-
ментами выяснилось, что УУГ кодирует фенилаланин, УГУ — серин, ЦУУ — лейцин. В некоторых случаях на подобных матрицах синтезировались не три, а два гомополипептида. Такими, например, были матрицы поли (ГУА) и поли (ГАУ). Причину этого мы рассмотрим позже.
