Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Листья
Апексы
Органы растений, из которых берут эксплант для введения в культуру, предварительно моют мыльным раствором с щеткой и споласкивают дистиллированной водой, а затем погружают на несколько секунд в 70 %-ный этанол. Семена погружают в спирт на 1—2 мин. Кроме собственно стерилизующего действия спирта обработка тканей этанолом перед помещением в основной стерилизующий раствор повышает стерилизующий эффект последнего.
После стерилизации растительные объекты должны быть тщательно промыты стерильной водой.
Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от наружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннюю инфекцию, то его необходимо обработать антибиотиками. Особенно богаты внутренней инфекцией ткани тропических и субтропических растений, имеющих крупные сосуды. Загрязнение культур грибами или бактериями обычно выявляется через 1 —14 дней после посадки. Загрязненные культуры необходимо тотчас же удалить, чтобы избежать заражения воздуха в световой комнате.
Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120° С и давлении 0,75—1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательной среды входят вещества, разрушающиеся при высокой температуре, их подвергают холодной стерилизации, пропуская через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22—0,45 мкм, после чего добавляют в проавтоклавированную охлажденную до 40° С основную среду.
Посуду, предварительно завернутую в фольгу или оберточную бумагу, стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160° С в течение двух часов.
Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также витамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток.
Для получения каллусной ткани в отдельных случаях к питательной среде добавляют жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана и др.
Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей, так как в большинстве случаев последние не способны к автотроф-ному питанию. Чаще всего в качестве углевода используют сахарозу или глюкозу в концентрации 2—3 %.
Фитогормоны необходимы для дедифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. Прэтому для получения кал-лусных тканей в состав питательных сред должны обязательно входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление клеток. В случае индук-
ции стеблевого морфогенеза содержание ауксинов в среде может быть снижено или они могут быть полностью исключены из питательной среды.
На безгормональной среде растут опухолевые и «привыкшие» ткани. Автономность по отношению к обоим гормонам или к одному из них связана со способностью этих клеток синтезировать гормоны.
В качестве источников ауксинов в питательных средах используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индо-лил-3-уксусную кислоту (ИУК), а-нафтилуксусную кислоту (НУК). Для получения рыхлого хорошо растущего каллуса чаще применяют 2,4-Д, так как ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д.
В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин, б-бензиламинопурин (б-БАП), зеатин. б-БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином. В состав некоторых сред входит аденин.
В настоящее время известно большое число различных по составу питательных сред, но наиболее часто применяемая при выращивании изолированных растительных тканей в условиях in vitro среда Т. Мурасига и Ф. Скуга, впервые составленная в 1962 г. Эта среда содержит хорошо сбалансированный состав питательных веществ и отличается от других, как правило, соотношением аммонийного и нитратного азота (табл. 1.2).
Таблица 1.2. Состав питательных сред для культивирования изолированных тканей растений
Компоненты питательной Концентрация, мг/л
Мурасн- Гамборга Шен Грее-
га --- Скуга ка--- Хиль- хофф - Доу
дебрандта
NH4NO3 1650 2500 2500 ---
NH4H2PO4 --- --- 300 ---
1 KN03 1900 --- --- 1000
СаС12 • 2Н20 440 150 200 150
MgS04 • 7Н20 370 250 400 250
(NH4)2S04 --- 130 200
КН2РО4 170 --- ---
