Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
К физиологическим факторам также относится и время (сезонность) изоляции экспланта. Ткани и органы, изолированные в момент вегетации растений, обладают более высокой чувствительностью к составу питательной среды и способны с высокой частотой образовывать адвентивные почки, формировать побеги и укореняться, чем ткани, изолированные в период глубокого и вынужденного покоя. Например, весенняя посадка апексов
крыжовника сорта Финик на питательную среду Мурасига и Скуга, содержащей БАП 0,5 мг/л, способствовала пролиферации каллуса, из которого затем индуцировались с высокой частотой побеги. В то время как летняя изоляция апексов стимулировала более интенсивную пролиферацию каллуса, но при этом уменьшался процент регенерации побегов.
Размер экспланта является еще одним фактором, определяющим успех микроразмножения. Чем меньше экспла,нт, тем меньшей регенерационной способностью он обладает, и наоборот. Экспланты большего размера, состоящие из паренхимы, проводящей ткани и камбия, могут независимо от соотношения фитогормонов в питательной среде спонтанно образовывать почки. С другой стороны, в крупном экспланте увеличивается возможность появления в его клетках вирусов и других патогенов, что препятствует оздоровлению размноженных в культуре тканей растений. Оптимальная величина экспланта зависит от видовых особенностей растения-донора и свойств органа, служащего источником первичного экспланта. Так, для малины был установлен размер первичного экспланта 2 мм, при котором 60% апикальных верхушек растения регенерировали на среде Мореля. Для хмеля этот показатель колеблется от 0,1 до 0,2 мм, а для лука и чеснока оптимальный размер меристемы составляет 0,5—0,8 мм.
У многих растений морфогенетическая способность изолированных тканей, и в частности меристематических, зависит от расположения почек на побегах. Так, исследуя регенерационную способность терминальных и латеральных почек побегов крыжовника сорта Русский показали, что наибольшим морфогенетическим потенциалом обладают три верхние почки (45—65%), а для растений спаржи было установлено, что почки нижней части побега обладают большей регенарационной способностью, чем почки средней и апикальной частей.
Гормональные факторы. Немаловажный фактор, влияющий на успех клонального микроразмножения,— гормональный баланс питательной среды. При высоком соотношении гормонов (цитокинин — ауксин) происходит развитие пазушных меристем или образование адвентивных почек, при низком — индуцируется корнеобразование, а при среднем — наблюдается образование и пролиферация каллуса. Наиболее часто при клональном микроразмножении используют ИУК, реже НУК в качестве ауксиновых компонентов, кинетин и БАП представляют при этом цитокинины. Кроме перечисленных двух цитокининов используются и другие, у которых активность в стимуляции образования побегов выше. Цитокинины, исполь-
зуемые в микроразмножении растений, по своей активности можно расположить в следующем порядке: кинетин < 6-бензи-ламинопурин (БАП) < 2-изопентениладенин (2ip) < зеатин.
Кроме цитокининов и ауксинов в питательную среду иногда добавляют гибберелловую кислоту, которая стимулирует рост и вытягивание (элонгацию) сформировавшихся почек и способствует получению растений с хорошо развитой надземной частью.
Принципиально возможна индукция и стимуляция различных морфогенетических реакций в культуре тканей с помощью низких концентраций экзогенных фитогормонов, и угнетение общей активности вплоть до гибели растительных тканей при высокой гормональной насыщенности питательной среды. Эту специфику реакций культивируемых тканей и органов растений на введение фитогормонов следует учитывать при использовании регуляторов роста с целью размножения растений.
На клональное микроразмножение, наряду с гормонами, влияют минеральные соли, витамины и углеводы. При микроразмножении растений in vitro часто используют среды Мура-сига и Скуга, Линсмаера и Скуга, Гресхофа и Доу, Нича, Хеллера, Шенка и Хильдебрандта и др., отличающихся друг от друга соотношением аммонийного и нитратного азота. В большинстве случаев исследователи отдают предпочтение среде Мурасига и Скуга, отличающейся высоким содержанием неорганического азота. Использование сред, обогащенных азотом, не только ведет к неорганизованному росту каллусной ткани, но и стимулирует процессы органогенеза и особенно соматического эмбриогенеза. Например, NH4NO:i влияет на морфогенетический потенциал зародышей разных видов Brassica. Процент выживания зародышей и частота образования побегов увеличиваются при уменьшении концентрации NH4N01 в среде, а максимальное число побегов на зародышах формируются в случае полного исключения NH4N0.4 из среды. Снижение содержания KNO^ и NH^O, до 6,7 мМ улучшало морфогенез крыжовника сортов Инвикта и Карлз. Для томатов экспериментально было установлено, что среды с повышенным содержанием минерального азота ингибируют пролиферацию каллуса и приводят к гибели эксплантов. Для глоксинии была отмечена зависимость образования вегетативных или репродуктивных структур от концентрации компонентов питательной среды. Так, при высокой концентрации KNO^ (20 мМ) и сахарозы (100 мМ) преимущественно развиваются вегетативные почки, а цветочные только у 28% эксплантов. При низком содержании KNO, (2 мМ) и сахарозы (15 мМ) на всех экс-плантах образуются только цветочные почки.
