Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Выделяют одиночные клетки из клеточных суспензий, из тканей растений, например, из мезофилла листа после его мацерации ферментами, из культуры изолированных протопластов после восстановления клеточной стенки.
Для получения одноклеточной фракции суспензионной культуры иногда достаточно простого отстаивания в колбе в течение 15—30 мин. При этом крупные агрегаты оседают на дно колбы, а надосадочная фракция содержит только одиночные клетки или мелкие агрегаты. В том случае, когда при отстаивании не удается получить одноклеточную фракцию, применяют мацерирующие ферменты, центрифугирование в градиенте сахарозы или фильтрование через сита (найлоновые или металлические).
Трудности культивирования одиночных клеток связаны с тем, что отдельная клетка не делится в тех условиях, в которых хорошо растет каллусная ткань. Для того чтобы заставить одиночные клетки делиться, разработаны специальные методы. В 1960 г. Джонсон предложил метод «няньки», при котором функцию «няньки», стимулирующей деление одиночной клетки, выполняют кусочки каллусной ткани, отделенные от нее фильтровальной бумагой. В присутствии «няньки» одиночная клетка делится и дает индивидуальную колонию клеток — клон.
Другой метод основан на использовании очень малых объемов богатой питательной среды и представляет собой культивирование одиночных клеток в микрокапле в чашке Купрака объемом 20 мкл. Метод предложен академиком Ю.Ю. Глебой. В микрокаплях удобно наблюдать за получением и делением клеток при соматической гибридизации.
Для индукции клеточных делений у одиночной клетки можно использовать также «кормящий слой» (активно делящиеся клетки 28
суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка)
(рис. 1.3). Стимулирует клеточное деление и кондиционирование среды, для чего в нее добавляют питательную среду от интенсивно делящейся культуры клеток. Кондиционирующий фактор получают при фильтровании клеточной суспензии в экспоненциальной фазе роста через бактериальный фильтр. По сути дела все перечисленные методы основаны на использовании выделений из делящихся клеток — кондиционирующего фактора.
Несмотря на многочисленные попытки определить химическую природу и раскрыть механизм действия кондиционирующего фактора на деление клеток, ясности пока нет. Однако уверенно можно сказать, что этот фактор термостабилен, водорастворим, включает низкомолекулярные вещества и не заменяется фитогормонами (А.И. Павлова, Р.Г. Бутенко, 1969). К сказанному можно добавить также, что вещество стабильно при pH 4-11, молекулярная масса eroWOO Д и этот фактор является синер-гистом брассиностероида (Beiiincampi, Morpurgo, 1987). Таким образом, исследования показали, что это не чисто химическое вещество, а сумма факторов, которые выделяются из клетки.
1.7. МОРФОГЕНЕЗ В КАЛЛУСНЫХ ТКАНЯХ
Существует несколько путей, по которым может идти развитие клетки после ее дедифференцировки. Первый путь — это вторичная регенерация целого растения, возможна дифферен-цировка на уровне клеток, тканей, органов. Второй путь — это утрата клеткой способности к вторичной дифференцировке и регенерации растения, стойкая дедифференцировка, приобретение способности расти на среде без гормонов, т.е. превращение в опухолевую. Такими свойствами часто характеризуются клетки старых пересадочных культур. Третий путь — это нормальный цикл развития каллусной клетки, заканчивающийся ее
Рис. 1.3. Использование в качестве «няньки» культуры суспензионных клеток прн выращивании изолированных протопластов и одиночных клеток кукурузы:
I — колонии клеток; 2 — фильтровальная бумага; 3—алюминиевая сетка; 4 — пенополиуретан;
5 — суспензия клеток (By Дык Ку-анг, З.Б. Шамина, 1985)
старением и отмиранием. В этом случае клетка претерпевает вторичную дифференцировку и прекращает делиться (стационарная фаза роста). Однако такая дифференцировка не ведет к морфогенезу, а закрепляет за ней свойства старой каллусной клетки.
Для сельскохозяйственной биотехнологии наибольший интерес представляет регенерация в культуре тканей из отдельной клетки целого растения. Иногда этот путь лежит через образование отдельных органов.
В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток. Существует два основных типа морфогенеза (рис. 1.4). В культуре тканей он может проявляться в виде органогенеза (образования монополярной структуры, т.е. отдельных органов): корневого, стеблевого, реже флорального (цветочного) или листового, а также в виде соматического эмбриогенеза (образования биполярных зародышеподобных структур из соматических клеток). В случае органогенеза сначала регенерируют отдельные органы, а затем уже из них — целые растения, исключение составляет корневой органогенез.
В результате соматического эмбриогенеза в отличие от органогенеза сразу образуется зародыш, имеющий как меристему корня, так и меристему верхушечной почки, из которого в дальнейшем развивается целое растение.
Способность отдельной соматической клетки полностью реализовывать свою программу развития и давать начало целому растительному организму называют тотипотентностью растительной клетки. Любая растительная клетка обладает одинаковыми потенциальными возможностями, так как содержит весь набор генов и, следовательно, клетки сохраняют свойственную зиготе программу развития. Поэтому если мы получаем каллус из клеток лепестка цветка, или из клеток сердцевинной парен-хемы стебля, или из клеток любой ткани, то в принципе каждая такая клетка может регенерировать целое растение. Однако свойство тотипотентности не всегда реализуется, так. как потенциальные возможности клеток разных типов проявляются 30
