Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Шевелуха Е.А. -> "Сельскохозяйственная биотехнология" -> 11

Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.

Шевелуха Е.А., Калашникова С.В., Дегтярев С.В., Кочиева Е.З. Сельскохозяйственная биотехнология — М.: Высшая школа, 1998. — 416 c.
Скачать (прямая ссылка): selskohoztehnika1998.djvu
Предыдущая << 1 .. 5 6 7 8 9 10 < 11 > 12 13 14 15 16 17 .. 180 >> Следующая

Для получения 100 мл клеточной суспензии необходимо 2—3 г свежей каллусной ткани.
Необходимым условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание или встряхивание среды. Если клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то деление суспензионных клеток приводит к образованию каллусной ткани.
Деление суспензионных клеток поддерживается при наличии ауксинов и цитокининов, т.е. тех гормонов, которые необходимы для индукции и роста каллусных клеток. Таким образом, суспензионные культуры представлены типичными каллусными клетками, обладающими всеми свойствами, характерными для клеток такого рода.
Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, получаемого на средах с 2,4-Д. Исключение из питательной среды ионов кальция облегчает суспендирование. Еще более облегчает этот процесс добавление в среду фермента пектиназы, который разрушает пектат кальция, склеивающий отдельные клетки.
Клеточные суспензии в биотехнологии используются для получения вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными лекарственными препаратами, для промышленного выращивания клеточной биомассы и для клеточной селекции. Наряду с этим, суспензии клеток можно применять в качестве исходного материала для получения изолированных протопластов.
При использовании суспензионных культур в качестве продуцентов вторичных веществ применяют закрытые или открытые системы ферментов в периодическом или проточном режимах выращивания клеток. В закрытой системе клеточная суспензия лишена притока свежей питательной среды до конца выращивания, а в случае непрерывного режима выращивания в открытой системе питательная среда меняется на свежую. Как при периодическом, так и при проточном режимах выращивания в открытой системе клетки остаются в питательной среде и не удаляются даже при ее замене. Однако в открытых системах культивирования при замене питательной среды (периодическом или непрерывном) вместе со средой отбирается и часть суспензионных клеток.
Для работы с клеточными суспензиями необходимо знать их характеристики: жизнеспособность/ плотность клеток в суспензионной культуре, степень агрегированности, скорость роста.
Жизнеспособность клеток определяют по их окрашиванию красителем (метиленовая синь или синь Эванса). Живые клетки не окрашиваются красителем вследствие непроницаемости для него клеточных мембран. В мертвые клетки краска легко проникает, и они окрашиваются в синий цвет.
Одним из основных показателей, характеризующих состояние клеточной суспензии, является плотность клеточной популяции. Число клеток определяют в счетной камере Фукса—Розенталя под микроскопом после мацерации (разделения клеток). В качестве мацерирующего вещества применяют хромовую кислоту (10—20 %-ная), которая гидролизует средние пластинки, соединяющие клетки.
Хорошо растущая суспензия имеет, как и каллусная культура, s-образную кривую роста. Обычно длительность пассажа составляет 14—16 дней. При этом плотность возрастает от 5* 104 до 5* 10е кл/мл. Суспензия для субкультивирования берется в конце экспоненциальной фазы. Увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы — основные критерии роста суспензионных культур.
Качество суспензии зависит от степени агрегированности ее клеток. Агрегаты не должны содержать более 10—12 клеток. Поэтому, чтобы избавиться от крупных агрегатов, суспензии фильтруют через марлевые, найлоновые или металлические фильтры. Одновременно это позволяет освободиться от остатков экспланта или плотных кусков каллусной ткани.
Для промышленного получения продуктов вторичного синтеза из больших клеточных масс используют ферментеры большой емкости (от 20 000 и более литров), в которых проводят непрерывное культивирование клеток. Наиболее распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система. Для аэрации и перемешивания суспензии используют качалки, роллеры, ферментеры с механическими и магнитными мешалками или ферментеры, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком.
Суспензионные культуры могут быть не только источником ценных вторичных метаболитов, но в них выявлены также новые необычные соединения, например, камптотецин, харрингто-нин и другие антиканцерогены, пептиды (ингибитор протеаз, ингибитор фитовирусов) и др.
Следует отметить, что деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных метаболитов достигает максимума в стационарной фазе роста.
1.6. КУЛЬТУРА ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК
Для генетических и физиологических исследований, а также для практического использования в клеточной селекции очень
ценным является культивирование отдельных клеток. Получение клона-потомства одиночной клетки помогает разобраться в причинах генетической неоднородности каллусных клеток, так как наблюдения в данном случае проводятся на ткани, полученной не из гетерогенного экспланта, а из одной клетки.
Одиночная гибридная клетка, выделенная из культуры изолированных протопластов, при дальнейшем ее делении позволяет получить клон, состоящий из гибридных клеток. Это намного облегчает работу исследователя, так как устраняет необходимость отбора потомства в культуре изолированных протопластов от негибридных, что представляет значительные трудности. Кроме того, сам процесс соматической гибридизации лучше наблюдать, если работа ведется с одиночными протопластами.
Предыдущая << 1 .. 5 6 7 8 9 10 < 11 > 12 13 14 15 16 17 .. 180 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed