Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Траисгенные живот 2 1 0,5 0,5---1 0,5
ные/пересаженные эм
брионы, %
Требующееся число жи 10 15 20 40 40
вотных для получения од
ного трансгенного живот
ного
Визуализация пронуклеусов в эмбрионах сельскохозяйственных животных и микроинъекция ДНК. Для введения генов в геном животного в настоящее время используют три основных метода:
микроинъекцня ДНК в пронуклеус зигот или в каждый бластомер у 2-клеточного эмбриона;
введение ДНК с использованием ретровирусных векторов; получение трансгенных химер из генетически трансформированных клеток и эмбрионов.
Наиболее распространен метод микроинъекции ДНК. Два других метода имеют ряд ограничений и пока не нашли применения на сельскохозяйственных животных.
Для микроинъекции эмбрионов необходим устойчивый стол, на котором устанавливают инвертированный микроскоп, два микроманипулятора для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления. На столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой парафиновым маслом. В среду помещают эмбрионы. Эмбрионы фиксируют посредством
пониженного давления на удерживающей пипетке так, чтобы инъецируемый пронуклеус был хорошо виден. Кончик инъекционной пипетки (внутренний диаметр около 1 мкм) наполняют раствором ДНК. Пипетку вводят в пронуклеус через прозрачную оболочку и клеточную мембрану и затем инъецируют 1—2 пкл раствора ДНК. О точности операции судят по набуханию пронуклеуса. Увеличение объема пронуклеуса свидетельствует о том, что раствор ДНК действительно введен. После инъекции эмбрионы освобождают от удерживающей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам.
В оплодотворенных яйцеклетках мыши и кролика, извлеченных в соответствии со стадией их развития, пронуклеусы очень хорошо видны и могут быть легко инъецированы. У эмбрионов сельскохозяйственных животных в цитоплазме имеются темные липидосодержащие гранулы, которые затрудняют визуализацию пронуклеусов. В результате центрифугирования при 15000 g/мин в течение 3—5 мин гранулы смещаются к одному полюсу яйцеклетки, а лежащие недалеко от центра пронуклеусы становятся видимыми и доступными для микроинъекций. Для эмбрионов овцы, как правило, не требуется центрифугирования: для визуализации пронуклеусов достаточно применить оптику Номарского с интерференционным контрастом. Несмотря на сложную обработку (центрифугирование), микроинъекция эмбрионов сельскохозяйственных животных все же сложнее и не может быть выполнена с такой же надежностью и эффективностью, как у мышей и кроликов.
Пересадка эмбрионов. После кратковременного культивирования in vitro проинъецированные эмбрионы хирургическим путем переносят в яйцеводы синхронизированных реципиентов.
Синхронизация охоты у реципиентов и доноров, от которых получают эмбрионы, является необходимым условием для успешного выполнения программы по переносу генов (эмбрионов), так как яичники, яйцеводы и матка должны находиться в соответствующей стадии, чтобы физиологически обеспечить дальнейшее развитие пересаженных эмбрионов.
Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи пересаживают 20—30 инъецированных зигот, причем у свиней все эмбрионы трансплантируются в один яйцевод, а у мышей и кроликов—раздельно по яйцеводам. У овец, коз и крупного рогатого скота каждому реципиенту пересаживают два-четыре эмбриона.
Синхронизация охоты достигается спариванием с вазэкто-мированными (стерильными) самцами, индукцией овуляции хо-250
рионическим гонадотропином человека (НСР), «мягкой» суперовуляцией или лютеолизом желтого тела.
Микроинъецированные яйцеклетки переносят реципиенту хирургической трансплантацией, так как бескровный доступ к яйцеводам даже у крупных сельскохозяйственных животных, кроме коров и кобыл, невозможен. С этой целью реципиентам под наркозом вскрывают брюшную полость, локализуют яичники и яйцеводы, контролируют реакцию яичников на индукцию овуляции (присутствие овуляционных точек, желтых тел) для исключения непригодных (несинхрозированных) реципиентов. Затем специальный катетер с находящимися в нем микроинъе-цированными эмбрионами вводят в яйцевод через воронку, после чего в канал яйцевода инъецируют среду с эмбрионами.
Чтобы пересаживать проинъецированные эмбрионы крупного рогатого скота нехирургическим путем в матку реципиента, их культивируют in vitro до стадии морулы.
Изучение интеграции и экспрессии генов у трансгенных животных. Для доказательства интеграции используют три основных метода: блот-анализ, дот-блот-анализ и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Материалом для исследований служат ядросодержащие клетки тканей или внутренних жидкостей организма исследуемых животных. Отбирают пробы тканей для крови (с добавлением антикоагулирующих веществ), из которых выделяют ДНК- Для блот-анализа, например, требуется 20—30 мкг ДНК. С помощью блот-анализа можно получить самое точное и надежное доказательство интеграции ДНК. Метод дот-блот-анализа используют для установления числа интегрировавших в геном копий. По технологии ПЦР результаты анализа могут быть получены за относительно короткое время и при наличии чрезвычайно малого количества клеточного материала.
