Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
В опухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в растительную клетку бактериального гена, отвечающего за этот процесс.
В 40-х годах XX в. Браун, ученик Ф. Уайта, показал, что культура ткани корончатогалловой опухоли даже в отсутствии агробактерий, например, после гибели их под воздействием по-
вышенной температуры, сохраняет опухолевые свойства. На искусственной питательной среде без гормонов ткань корончатого галла, лишенная бактерий, продолжала интенсивно пролиферировать. Ткани корончатых галлов содержат более высокие уровни ауксинов, чем нормальные, и продуцируют несколько цитокининов. На основании своих опытов Браун пришел к выводу, что растительные клетки каким-то образом трансформируются (превращаются) в опухолевые после воздействия Agrobacterium tumefaciens. Было выдвинуто предположение, что агробактерии вводят в клетки растения фактор Tip (Tumor inducing principle), который за 36 ч превращает нормальные клетки в опухолевые. В дальнейшем оказалось, что Tip представляет собой ДНК и находится в большой плазмиде агробактерий (Ti-плазмида). Онкогенная активность может быть утрачена в результате удаления из бактериальной клетки всей Ti-плазмиды или ее определенной части.
В 1977 г. Чилтон с сотр. доказали, что опухоли корончатого галла возникают в результате включения определенного фрагмента Ti-плазмиды агробактерий в растительную ядерную ДНК.
Таким образом, сегмент Ti-плазмиды (Т-ДНК) интегрируется в хромосому и становится частью наследственного аппарата трансформированной (опухолевой) растительной клетки. Интеграция Т-ДНК Ti-плазмиды агробактерий в хромосому растения приводит к появлению опухоли и гормононезависимому росту опухолевых клеток на искусственных питательных средах. Оба эти явления тесно связаны друг с другом, так как именно гормононезависимость, являющаяся следствием экспрессии генов, контролирующих синтез ауксинов и цитокининов, приводит к дедифференцировке и пролиферации клеток.
Ti-плазмида является природным вектором (переносчиком) новых генов в растения. Путь синтеза ауксинов и цитокининов клетками опухолей, индуцированных агробактериями, иной, чем у нормальных и «привыкших» клеток. Он более простой и короткий. С помощью мутагенов стало возможным идентифицировать участки Т-ДНК, контролирующие изменения гормональной активности. Было выяснено, что не один локус, а ряд генов ответственны за опухолевый рост.
Кроме ауксинов и цитокининов Т-ДНК детерминирует синтез галлами нового класса аминокислот, не встречающихся в природе — опинов. Эти вещества не являются причиной возникновения опухолей: они синтезируются в уже образовавшейся опухолевой ткани. Опухоли начинают синтез опинов в возрасте нескольких дней, например, на коланхоэ синтез опинов начинается на 7-й день с момента индукции опухолей. Опины — про-
изводные аминокислот, различных кетокислот и сахаров. Они являются биологически активными соединениями нового типа, обнаруживаемыми только в тканях корончатых галлов у растений, поэтому их можно рассматривать как биохимические маркеры для клеток корончатых галлов. Опины служат питательным веществом для агробактерий, однако опухоли продолжают продуцировать эти соединения и в стерильных культурах, не содержащих агробактерий. Известно три типа опинов: нопалин, октопин и агропин. Одни штаммы бактерий индуцируют окто-пинпродуцирующие опухоли, другие нопалинпродуцирующие.
Итак, первое общее свойство «привыкших» и опухолевых тканей, индуцированных агробактериями, заключается в гормононезависимости, связанной с приобретением способности интенсивно синтезировать гормоны. В галловых опухолях такая способность возникает в результате переноса чужеродного гена из бактериальной клетки в растительную. В клетках химических опухолей («привыкших» тканях) это же свойство связано, как полагают, с депрессией генов, отвечающих за синтез гормонов, однако оно может быть связано и с мутациями.
Второе общее свойство, которое вытекает из первого,— потеря способности «привыкших» и опухолевых клеток, индуцированных агробактериями, регенерировать фертильные растения. Галловые опухоли в подавляющем большинстве случаев не способны к регенерации нормального растения. Иногда они образуют тератомы (уродливые органоподобные структуры), которые не могут развиваться нормально.
«Привыкшие» ткани обычно также не регенерируют нормальных растений, их клетки утрачивают способность ко вторичной дифференцировке и морфогенезу. Однако в некоторых случаях, варьируя составы питательных сред, удается отодвинуть порог «привыкания». Следовательно, имеется резерв, использование которого позволит получать растения-регенеранты из все более длительно пассируемых тканевых культур.
1.5. КУЛЬТУРА КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ
Суспензию клеток можно получить из каллуса, поместив его в жидкую питательную среду с автоматическим перемешиванием. Используя фермент, например пектиназу, получаем суспензионную культуру непосредственно из ткани экспланта (лист, стебель, корень и т. д.). Вначале на поверхности экспланта образуется каллусная ткань, а затем уже от нее отделяются клетки и клеточные агрегаты, в результате чего получается клеточная суспензия.
