Производство белковых продуктов из масличных семян - Щербаков В.Г.
Скачать (прямая ссылка):
Техника выполнения заключается в следующем. Образец массой 100 г гидратируют в течение 1 ч при температуре 22° С, добавляя такое расчетное коли-
чество воды, чтобы получить сырой образец, содержащий 15% белка. Это может достигаться обработкой под давлением пара 0,014 МПа и затем охлаждением до 25—30° С. Сырой остаток резмельчают в мясорубке с сеткой, имеющей отверстия диаметром 3,1 мм. 100-греммовый размельченный сырой остаток промывают водой под давлением 0,014 МПа в течение 1 мин на сите 20 меш. Промытый остаток высушивают в течение 3 мин. Стенки и дно сита выти реют фильтровальной бумагой для удаления избытка влаги перед взвешиванием. Масса сырого остатка (в граммах) на сите соответствует процентному содержанию структурированной целостности [ 65 ].
Определение молекулярной массы белков. Молекулярную массу белков определяют методом гель-хроматографии. Этот метод разделения веществ основан на различии их молекулярной массы. Он позволяет также выделять индивидуальные белки и определять их концентрацию.
Для гель-хроматографии используются специальные гели, представляющие собой видоизмененные декстраны. Наиболее применим гель под фирменным названием "сефадекс".
Различные марки сефадексов обладают различными пределами экслюзии — значениями молекулярной массы веществ, еще способных входить внутрь гранул сефадекса.
Важное использование сефадексов состоит в разделении веществ по молекулярной массе путем гель-фильтрации.
Сущность гель-фильтрации заключается в том, что при пропускании растворов белков через колонку с набухшим сефадексом низкомолекулярные соединения входят в поры зерен сефадекса и таким образом задерживаются. Высокомолекулярные соединения проходят через колонку, не задерживаясь. Подбирая сефадексы по размерам, можно отделить низкомолекулярные соединения от белков.
Сефадексы могут различаться по своему отношению к различным растворителям.
С помощью сефадексов помимо разделения многокомпонентных смесей можно определять молекулярную массу белков (при наличии метчиков с известной молекулярной массой). Определение молекулярной массы основано на том, что элюирующий объем растворителя для глобулярных белков весьма близок к прямой зависимости от молекулярной массы. Этот метод является единственным, позволяющим определить молекулярную массу белков без предварительной очистки сырых экстрактов.
Также с помощью гель-фильтрации на сефадексах можно обессоливать растворы макромолекул, например отделять соли от альбуминов, очищать органические вещества растворов. Гель-фильтрация используется для концентрирования определенных веществ.
Техника выполнения заключается в следующем. В двухлитровый стакан 27 г сефадекса заливают 1,5 л 0,09 М рествора хлористого натрия при периодическом перемешивании стеклянной палочкой, рествор оставляют на 3—12 ч для набухания сефадексе.
Набухший сефадекс переносят в вертикальную колонку при постоянном перемешивании и свободном истекании из колонки элюирующего рествора. При этом необходимо добиться ревномерного заполнения колонки и горизонтальной верхней поверхности набухшего сефадекса. Для этого можно использовать кружок (по внутреннему диаметру колонки) фильтровальной бумаги.
После заполнения колонки пропускают 250—300 мл элюирующего раствора и сливают его через нижний краник, оставив слой 0,5—1 см над верхней поверхностью сефадексе.
С помощью пипетки, имеющей капиллярный конец, или шприца осторожно наслаивают исследуемый рествор бепка на верхний слой сефадексе до того момента, когда слой элюирующего растворе при открытом нижнем кренике сравняется с верхним слоем сефадекса.
При достижении уровнем растворе белка верхнего слоя сефадекса (кружка фильтровальной бумаги) пипеткой наслаивают 10—20 мл элюирующего рестворе и затем подключают питающую емкость (или насос, подающий элюирующий рествор).
Элюирующие фрекции со би ре ют в отдельные пробирки вручную или автоматическим коллектором фрекций по определенному объему.
Количество белка определяют спектрофотометрически при 260 и 280 нм, сопоставляя со стандартным раствором метчиков. Устанавливают зависимость количества белка в собранных фрекциях от количества полученного рествора.
По окончании реботы колонку промывают 150—200 мл элюирующего рествора. При длительном хранении в последние порции промывающего рествора до-бевляют антисептик (0,02% азида натрия или хлороформа).
Определение выхода белкового изолята. Экстракцию белков из обезжиренных семян (шрота) проводят в зависимости от поставленной цели растворами поваренной соли или щелочей.
Из полученных экстрактов осаждают белки добавлением кислоты до достижения изоэлектрической точки. При необходимости промывкой растворами кислот удаляют нежелательные компоненты (например, хлорогеновую кислоту). Отделенные белки сушат под разрежением или при сочетании его с низкими температурами (лиофильная или сублимационная сушка).
Техника выполнения заключается в следующем. Навеску шрота 50 г заливают 600 мл 5%-ного рествора поваренной соли (темперетуре рестворе 45°С). При термостатировании (45° С) перемешивают в течение 10 мин с частотой вращения мешалки 100—110 об/мин.
