Нейро-биология Том 1 - Шеперд Г.
Скачать (прямая ссылка):
3. Физиологический: демонстрация того, что физиологическая стимуляция заставляет пресинаптическое окончание выделять данное вещество и что его ионофоретическая инъекция в область синапса в подходящих количествах имитирует естественную реакцию.
4. Фармакологический: фармакологические препараты, которые влияют на различные ферментативные или биофизические этапы, оказывают ожидаемое действие на синтез, накопление, высвобождение, активность, инактивацию и обратный захват данного вещества.
Этапы для нейропептидов
1. Разработка количественной биопробы.
2. Свидетельства того', что данное биологически активное вещество по своей природе является пептидом.
3. Разработка процедур экстракции и выделения для получения максимально очищенного пептида
4. Химическая и физическая характеристика очищенного пептида (например, определение молекулярной массы и аминокислотного состава)
5. Выяснение аминокислотной последовательности пептида
6. Химический синтез пептида (и последующее тестирование его на биоактивность с применением количественной биопробы)
7. Получение антител к пептиду
8. Характеристика антител с использованием синтетических аналогов данного пептида (очистка антител)
9. Разработка иммунологических проб и процедур для применения на нервных тканях (типа радиоиммун-нон пробы и иммуноцитохимиче-ского метода)
единений были обнаружены и идентифицированы в других органах биохимиками, работавшими 50 лет назад или около того, и были только недавно обнаружены в нервной системе. Названия этих соединений, такие как «вазопрессин» или «простаглан-дин», отражают те органы, в которых они были обнаружены впервые, или то физиологическое действие, которое было изучено первым. Аналогично, некоторые из них имеют названия вроде «люлиберин» или «рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона» (ЛГ-РФ), отражающие одну из специфических функций нервной системы. Ряд пептидов, ранее идентифицированных в кишечнике, затем был обнаружен в центральной нервной системе. Так что номенклатура этих веществ может быть несколько запутанной.
Подобно медиаторам, пептиды можно идентифицировать как нейроактивные вещества по соответствию их нескольким критериям. Хотя число их пока не установлено, перечень, приведенный в табл. 9.1, может послужить полезным руководством. Он
220
//. Клеточные механизмы
начинается с биопробы, которая включает определенные процедуры для экстракции и тестирования, являющиеся в действительности весьма строгими. Выделение и определение пептида обеспечивается набором методов хроматографии и другими стандартными биохимическими приемами. Локализация пептидов в нервных тканях опирается на иммунологические методы, которые особенно эффективны ввиду их высокой чувствительности и специфичности. Способность данного вещества вызывать реакции при нанесении его на данный нейрон в эксперименте является последним и очень важным критерием, но только одним из многих.
Одно из крупнейших достижений последних лет — возможность локализовать нейроактивные вещества типа пептидов внутри отдельных нейронов, используя иммунологические методы. Коротко говоря, интересующее вещество (X) сначала вводят как антиген в организм подходящего для этого животного (кролика), чтобы вызывать появление антител (анти-Х) в крови. Затем делают срезы тех нервных тканей, в которых желательно установить клеточную локализацию X. Эти срезы обрабатывают рядом агентов, начиная с анти-Х, который затем заставляют реагировать с другими антителами — к анти-Х. Эти вторые антитела связывают агентами, обеспечивающими визуализацию; обычно это молекулы флуоресцирующего вещества или фермент — пероксидаза хрена. Пример получаемых результатов показан на рис. 9.8.
Рис. 9.8. Иммуноцитохимическое выявление нейроактивных пептидов. Серийные срезы ядер шва продолговатого мозга, обработанные антисыворотками, специфическими в отношении серотонина (А), тиреолибернна (Б) и вещества Р (В). Можно видеть, что в нескольких клетках (1—4), идентифицируемых на всех трех срезах, имели место иммунные реакции со всеми тремя антисыворотками. Метка X поставлена на кровеносном сосуде, использованном для ориентирования срезов. (Johansson et ah, 1981.)
9. Медиаторы и модуляторы
При только что описанной процедуре исходные антитела; (анти-Х) продуцируются всей иммунной системой кролика. Следовательно, эти антитела поликлональны, ибо их вырабатывают’ лимфоциты, обладающие разной степенью специфичности по отношению к X. Моноклональные антитела, вырабатываемые клетками-потомками одного лимфоцита, можно получить соответствующим скринингом, отобрав лимфоциты желательной специфичности. Получение моноклональных антител обещает сильно увеличить специфичность иммуноцитохимических методов идентификации нейроактивных веществ в нейронах. Кроме того, этот общий метод можно приспособить для еще более тонких измерений, таких как визуализация специфической РНК,, в которой закодирован синтез определенного пептида или белка (см. гл. 4).
