Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
красители могут быть непосредственно использованы при ИЭФ.
Аналитическое ИЭФ
22$
таноле.] Следует использовать очищенный глутаровый альдегид категории
Biological grade. 2-й этап. Погружают гель на 10 мин в дистиллированную
(в стекле) воду (0,5-1 л), меняют воду дважды и оставляют в воде не
меньше чем на 2 ч (по возможности лучше на ночь). 3-й этап. Сливают воду
и добавляют свежий аммиачный раствор серебра, который готовится следующим
образом (в расчете на 100 мл раствора) : 1,4 мл концентрированного
водного раствора аммиака прибавляют к 21 мл 0,36%-ного NaOH, все время
перемешивая смесь, медленно добавляют 4 мл 19,4%-ного раствора AgN03 (для
приготовления, которого 20 г AgN03 растворяют в 100 мл дистиллированной
воды). Коричневый осадок, который может образоваться при добавлении
раствора AgNC>3 к щелочи, при перемешивании постепенно исчезает. Гель
должен свободно плавать в растворе (следует взять 100-150 мл раствора).
Во избежание выпадения серебра на поверхности геля время окрашивания не
должно превышать 15 мин. 4-й этап. Переносят гель в другой резервуар с
дистиллированной водой и отмывают в течение 2 мин.
5-й этап. Помещают гель в свежеприготовленный 0,005 %-ный раствор
лимонной кислоты в 0,019%-ном формальдегиде (который получают, разбавляя
38%-ный формальдегид 10-15%-ным метанолом). На этом этапе становятся
видны окрашенные белковые зоны. Как только начинает проявляться темный
фон, гель извлекают из раствора и начинают промывать (не менее 1 ч).. В
случае "переэкспонирования" в красителе гель можно частично обесцветить в
фотоослабителе Kodak rapid fixer. Обесцвечивание можно остановить,
перенеся гель в другой состав - Kodak hypo cleaning agent с нормальным
(1:4) разбавлением.
2. Фотохимическое окрашивание серебром по Merril et al., 1981.
Фиксируют гель в 50%-ном метаноле - 12%-ной уксусной кислоте не менее 20
мин, а затем 3 раза по 10 мин промывают порциями по 200 мл раствора,
содержащего 10% этанола и 5% уксусной кислоты. После этого 5 мин
вымачивают гель в 200 мл раствора, содержащего бихромат калия (3,4 мМ) и
азотную кислоту (3,2мМ). Промывают четырьмя порциями дистиллированной
воды (по 200 мл по 30 с) и на 30 мин помещают гель в 12мМ раствор AgN03
(200 мл). Максимальная чувствительность достигается при интенсивном
освещении в течение первых 5 мин инкубации с помощью яркой флуоресцентной
лампы. Развитие окраски происходит в процессе быстрой промывки двумя
порциями по 300 мл раствора, содержащего 0,28 М карбонат-натрия и 0,5 мл
аптечного формалина (на 1 л раствора). Гель-промывают третьей порцией
этого раствора до достижения желаемой интенсивности окрашивания.
Останавливают окрашивание перенесением геля в 1 %-ный раствор уксусной
кислоты. Повышение чувствительности за счет освещения наблюдается
Глава 3
Таблица 3.5. Последовательность операций при цветном окрашивании серебром
гелей после электрофореза (по Sammons et al., 1981)
Операции
Растворы
Продолжительность
обработки
Фиксирование
Промывание
Обработка серебром Промывание Восстановление серебра Усиление цветности
50%-ный этанол, 10%-ная уксусная 2 ч или более
кислота
50%-ный этанол, 10%-ная уксусная 2 ч
кислота
25%-ный этанол, 10%-ная уксусная Дважды по 1 ч
кислота
10%-ный этанол, 0,5%-ная уксусная Дважды по 1 ч
кислота
AgN03 (1,9 г/л) 2 ч или более
Н20 10-20 с
NaBH* (87,5 мг/л) и НСНО 10 мин
(7,5 мл/л) в 0,75 N NaOH
Na2C03 (7,5 г/л) 1 ч
Na2C03 (7,5 г/л) 1 ч, хранение
только при работе с гелями толщиной менее 1 мм. Сообщалось, что
предельная чувствительность метода достигает 0,01 нг бел-гка на 1 мм2.
3. Цветное окрашивание серебром по Sammons et al., 1981.
Последовательность операций в этом методе приведена в табл. -3.5. Гель
выдерживают в течение ночи в 50%-ном этаноле - 10%-ной уксусной кислоте
(объем геля: объем раствора=1:5,5). Такая длительная обработка необходима
главным образом для гелей, содержащих ДДС-Na, а после ИЭФ достаточно, как
пра-шило, 1-2 ч (в зависимости от толщины геля). Если нет возможности
сразу приступить к окрашиванию, то можно оставить гель в растворе
последней стадии промывки - 10%-ный этанол - 0,5%-ная уксусная кислота.
Существенно, что использу-•емые при окрашивании растворы перед
употреблением должны -быть деаэрированы. Оптимальная концентрация AgN03
для 1,5-мм гелей составляет 1,9 г/л; равновесие окрашивания достигается
при этом за 2 ч. Оптимальное соотношение объемов геля и окрашивающего
раствора - 1:3. Восстанавливающий раствор -содержит NaOH (0,75 М),
формальдегид (7,5 мл/л; готовится из 37%-ного аптечного формалина) и
NaBH4 (87,5 мг/л) (объем теля: объем раствора =1:5,5). Формальдегид
следует добавлять 'к раствору непосредственно перед употреблением. Через
10 мин тель извлекают из восстанавливающего раствора и помещают в
раствор, усиливающий цветность. Цветная окраска развивается по мере
диффузии соды в гель в течение нескольких часов. Мак-
Аналитическое ИЭФ
225
